Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

As membranas celulares são sistemas altamente lotados e complexos¹. O apinhamento molecular pode ter um impacto considerável na difusão de entidades ligadas à membrana, como proteínas e lipídios ^2,3,4. Da mesma forma, reações bimoleculares em membranas lipídicas como a dimerização de receptores ou a oligomerização de complexos de membranas são influenciadas pelo apinhamento ^5,6,7. A natureza, a configuração e a concentração de crowders podem governar a ligação da membrana, a difusividade e a interação proteína-proteína de várias maneiras ^8,9. Como controlar o aglomeramento de membranas nas membranas celulares e interpretar sua influência sobre as biomoléculas embutidas é um desafio, os pesquisadores têm tentado estabelecer sistemas in vitro alternativos¹⁰.

Uma abordagem popular para membranas artificiais apinhadas é a dopagem das membranas bicamadas com lipídios enxertados com polímero (como polietilenoglicol, PEG)^11,12. Durante a visualização da dinâmica de proteínas e lipídios em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), esses polímeros adicionalmente protegem os componentes embutidos na membrana do substrato subjacente carregado negativamente (como o vidro), levantando efetivamente a bicamada para longe do suporte subjacente. Variando o tamanho e a concentração do polímero, pode-se controlar a extensão do apinhamento molecular, bem como sua separação do suporte sólido subjacente^13,14. Esta é claramente uma vantagem sobre as bicamadas lipídicas suportadas em substratos sólidos sem almofadas poliméricas^15,16, onde as biomoléculas transmembranares podem perder sua atividade^17,18,19. Mais importante, nos permite recapitular o ambiente lotado da membrana celular in vitro, o que é crítico para muitos processos de membrana.

Polímeros enxertados superficialmente em membranas também sofrem alterações em sua configuração dependendo de sua densidade de enxerto¹². Em baixas concentrações, eles permanecem em uma configuração entropicalmente enrolada, conhecida como cogumelo, acima da superfície da membrana. Com o aumento da concentração, eles começam a interagir e tendem a se desenrolar e se estender, finalmente produzindo uma densa formação em forma de escova na membrana²¹. Uma vez que a transição do cogumelo para o regime de escova é altamente heterogênea e se manifesta em condições mal caracterizadas do polímero, é importante usar condições bem caracterizadas para apinhamento em membranas enxertadas com polímero. Em comparação com um estudo recente²⁰, identificamos e relatamos composições de membranas lotadas que mantêm o transporte difusivo e a atividade das biomoléculas transmembranares.

Neste protocolo, discutimos como gerar membranas lipídicas PEGiladas e fornecemos recomendações para densidades de PEG que imitam o apinhamento em dois regimes diferentes de configuração polimérica (a saber, cogumelo e escova). O protocolo também descreve a ligação de molécula única, o rastreamento de partículas e a aquisição e análise de dados de fotobranqueamento para moléculas embutidas nessas membranas lotadas. Primeiro, descrevemos as etapas de limpeza completas, a montagem da câmara de imagem e a geração de PEG-SLBs. Em segundo lugar, fornecemos detalhes para os experimentos de ligação de molécula única, rastreamento de partículas e fotobranqueamento. Em terceiro lugar, discutimos i) extrair as afinidades relativas de ligação, ii) caracterizar a difusão molecular e iii) contar subunidades em um conjunto de proteínas a partir de filmes de moléculas individuais na membrana.

Embora tenhamos caracterizado esse sistema com imagens de molécula única, o protocolo é útil para todos os biofísicos de membrana interessados em entender o efeito do aglomeração em reações biomoleculares em membranas lipídicas. No geral, apresentamos um pipeline robusto para a fabricação de bicamadas lipídicas lotadas e suportadas, juntamente com vários ensaios de molécula única realizados sobre eles e as rotinas de análise correspondentes.