Levering af kardioaktive lægemidler i en porcin myokardieinfarktmodel

Koronararteriesygdom (CAD) og tilhørende ST-elevation myokardieinfarkt (STEMI) er de fremtrædende dødsårsager på verdensplan. I de sidste to årtier er der gjort store fremskridt med at reducere dødeligheden på hospitalet hos patienter, der præsenterer STEMI, gennem fremkomsten af perkutan koronar intervention, fibrinolytiske terapier og standardisering af behandlingsalgoritmer for at sikre, at reperfusion opnås rettidigt ^1,2,3. På trods af dette er sygeligheden forbundet med STEMI fortsat en betydelig byrde, hvilket skaber et stort behov for at udvikle nye kardiobeskyttende og regenerative terapier ^2,3. En væsentlig komponent i terapeutisk udvikling er bestemmelsen af, hvordan en ny behandling skal administreres⁴. Sikkerheden, effektiviteten og gennemførligheden af hver metode skal matches med egenskaberne ved selve terapien.

Fysiologisk relevante store dyremodeller er afgørende for vurderingen af disse egenskaber ved forskellige terapeutiske leveringsstrategier⁵. På grund af deres ligheder med mennesker i kardiovaskulær fysiologi, koronar vaskulær anatomi og hjertevægt til kropsvægtforhold er svin en af de foretrukne arter i den prækliniske evaluering af nye terapier til myokardieinfarkt⁶. Vi har tidligere brugt en STEMI-model til svin til at demonstrere reparativ kapacitet af en rekombinant proteinterapi⁷ og fortsætter med at undersøge nye farmakologiske, cellulære og genetiske terapier ved hjælp af denne model. Her beskrives tre teknikker til terapeutisk administration, der anvendes i svinemodeller efter infarktdannelse: thoracotomi og transepikardieinjektion, perkutan transendokardieinjektion og jugular venøs osmotisk minipumpeimplantation. De to første metoder muliggør lokal vævstilførsel, hvilket reducerer nødvendige doser, off-target effekter og hepatisk first-pass metabolisme ^8,9,10. Den osmotiske minipumpe tillader kontinuerlig levering af et lægemiddel med en kort halveringstid, hvilket ophæver afhængigheden af en infusionspumpe og patentintravenøs kanyle, som begge er udfordrende at indføre i store dyremodeller.

Ved at beskrive disse teknikker håber man, at denne artikel kan hjælpe translationelle forskere med at undersøge nye kardioprotektive eller regenerative midler efter myokardieinfarkt i store dyremodeller.

Alle forsøg blev udført efter 'Australian Code for the care and use of animals for scientific purposes' og blev godkendt af Western Sydney Local Health District Animal Ethics Committee. Præpubertære store hvide x landracegylte, der vejer 18-20 kg, blev brugt til denne undersøgelse.

1. Husdyrhold

1. Opstalde dyrene i henhold til lokale dyreetiske komitéregler.
   BEMÆRK: Dyrene i denne protokol opstaldes individuelt for at undgå kampe og skader og sikre, at der ikke er nogen konkurrence om mad. Men alle dyr kunne se, høre og lugte artsfæller. Deres kuglepenne har betongulve for nem rengøring og har både en indendørs og udendørs beskyttet del. Svinene forsynes med halmstrøelse i den indendørs del og berigelseslegetøj i den udendørs del.

2. Sedation og generel anæstesi

1. Sedation
   1. Sørg for, at dyret har været fastet i mindst 12 timer, før du påbegynder kraftig sedation eller generel anæstesi.
   2. Hvis dyret endnu ikke har vaskulær adgang i form af en central linje, skal du bruge en intramuskulær beroligende protokol.
   3. Intramuskulær sedation består af 8 mg/kg ketamin, 0,3 mg/kg midazolam, 0,2 mg/kg metadon og 10 μg/kg medetomidin (se materialetabel). Administrer denne blanding i dyrets epaxiale muskulatur med en 21 G nål. I gennemsnit tager dyrene 5-10 minutter at blive stærkt bedøvede.
      BEMÆRK: En stresset gris er mere modstandsdygtig over for sedation; Sørg for, at en rolig og selvsikker håndterer bedøver dyret, og at dyret ikke stresses unødigt. Hvis dyret bliver stresset, er det bedst at lade dem være alene i 5-10 minutter og prøve igen.
   4. Udfør intravenøs sedation, hvis en central linje er på plads og patenter. Intravenøs sedation består af 2 mg/kg ketamin, 0,2 mg/kg midazolam, 0,2 mg/kg metadon og 2 μg/kg medetomidin.
   5. Skyl den intravenøse slange med 0,9% natriumchlorid først for at sikre åbenhed. Skub derefter langsomt halvdelen af den blandede sprøjte gennem slangen og skyl med 0,9% natriumchlorid.
   6. Overhold dyret, som skal være stærkt bedøvet inden for 20-30 s. Hvis dyret endnu ikke er bedøvet, skylles den resterende halvdel af sprøjten som beskrevet i trin 2.1.5.
2. Vaskulær adgang
   1. Når grisen er behørigt bedøvet, transporteres den ind på operationsstuen.
   2. Forilte grisen med en ansigtsmaske og en iltgennemstrømningshastighed på 5 l/min. Tilslut et pulsoximeter til grisens hale, ører eller tunge for at overvåge dyret hele vejen igennem.
   3. Brug en 22 eller 24 G kanyle til at få adgang til både venstre og højre marginale øreårer og fastgør med tape.
3. Generel anæstesi
   1. Placer grisen i bryst liggende.
   2. Administrer 1-3 mg/kg propofol (se materialetabel) intravenøst som et langsomt tryktitreret til effekt. Få en assistent til at holde dyrets mund åben (kæben skal være slap på dette stadium) og forlænge nakken.
   3. Brug et laryngoskop (se materialeoversigt) til at trykke bunden af tungen og epiglottis for at udsætte arytenoidbrusk i strubehovedet.
   4. Før et smurt endotrakealt rør (størrelse 5,5 eller 6,0; se materialetabel) med en stylet gennem arytenoidbrusk og ind i luftrøret. Lejlighedsvis kan modstand mærkes, mens den passerer gennem strubehovedet; Dette kan imødegås med blid rotation af endotrachealrøret. Hvis dyret modstår intubation, skal du administrere mere propofol intravenøst.
   5. Fjern stylet fra endotrachealrøret. Oppust endotrachealrørmanchetten, indtil du er sikker på, at der ikke er luftlækager omkring røret. Generelt kræves 4-6 ml luft, selvom volumenet kan variere afhængigt af rørstørrelsen og dyret.
   6. Fastgør endotrachealrøret bag dyrets ører.
   7. Tilslut dyret til et rebreathing anæstesikredsløb med en volumenregulerende ventilatorfunktion. Når dyret er tilsluttet, skal ventilatoren være slukket.
      BEMÆRK: Sørg for, at den justerbare trykbegrænsende ventil (APL) eller 'pop-off-ventil' altid er åben. Undladelse af at lade ventilen være åben kan resultere i dødelig barotrauma for dyret.
   8. Reducer anæstesikredsløbets iltstrømningshastighed til 2 l / min.
   9. Indstil ventilatoren med positivt tryk til tilstanden 'volumenregulering'. Indstil tidevandsvolumen til 10 ml/kg og respirationsfrekvens til 20 vejrtrækninger/min. Sørg for, at forholdet mellem inspiratorisk:ekspiratorisk og udåndingsmiddel er indstillet til 1:2.
   10. Under hele proceduren manipuleres respirationshastigheden for at sikre, at slutvandskuldioxiden ligger mellem 35-50 mmHg.
       BEMÆRK: Inspiratorisk tryk må ikke overstige 20 cmH₂O. Stigninger i inspiratorisk tryk hurtig undersøgelse for slangeknæk eller blokeringer. For at afhjælpe øget tryk, der ikke er forbundet med slanger, kan inspiratorisk:ekspiratorisk forhold reduceres til 1:1,5, og tidevandsvolumen reduceres.
   11. Hvis dyret er hæmodynamisk stabilt, skal du opretholde dem med inhalationsbedøvelse. Hvis dyret ikke er hæmodynamisk stabilt, skal du opretholde dem med total intravenøs anæstesi som beskrevet i trin 2.3.14.
       1. Hvis dyret skal gives inhalationsanæstesi, påbegyndes med 2,5% isofluran fra det øjeblik, anæstesikredsløbet først tilsluttes.
       2. I løbet af de næste 30 minutter fravænnes dyret gradvist til 1,5 % inhaleret isofluran. Hold dyret på 1,5% isofluran indtil afslutningen af proceduren.
       3. Vurder anæstesidybden hvert 10. minut ved at kontrollere palpebrale reflekser og teste kæbetonen. Isofluran justeres efter behov for at bevare anæstesidybden.
   12. Hvis dyret er hæmodynamisk ustabilt, skal du opretholde dem med total intravenøs anæstesi, hvilket giver mulighed for større anæstesidybdekontrol uden de kardiovaskulære komplikationer forbundet med inhalationsmidler.
       1. Forbered enten sprøjtepumper eller standard væskepumper med propofol, fentanyl og midazolam. Forbind disse til dyret via en fælles linje.
          BEMÆRK: Propofol kan køres ved 0,1-0,6 mg / kg / min, fentanyl kan køres ved 1-5 μg / kg / time, og midazolam kan køres ved 0,05-0,2 mg / kg / time.
       2. Som med inhalationsanæstesi titreres disse lægemidler til virkning gennem hele anæstetien for at opretholde passende anæstesidybde.
   13. Giv intravenøs væskestøtte med 0,9% natriumchlorid eller Hartmanns opløsning (se materialetabel) med en hastighed på 5 ml/kg/t.
   14. Overvåg dyret med blodtryksmålinger, kapnografi, anæstesigasovervågning, temperatur, pulsoximetri og elektrokardiografi.
   15. Under enhver procedure skal der gives yderligere analgesi i form af 0,2 mg / kg metadon intravenøst hver 4. time efter præmedicinering.
       BEMÆRK: Analgesi kan administreres med kortere intervaller, hvis dyret viser tegn på smerte under anæstesi (takykardi, lysnet anæstesidybde uden ændringer i vedligeholdelsesmedicin).

3. Placering af central linje

1. Placer grisen i dorsal liggende med bagbenene udstrakt, venstre forben forlænget og højre forben bøjet og sikret med slips.
2. Aseptisk forberede grisens hals og dække med en drapering.
3. Brug en lineær ultralydssonde (se materialetabel) med en steril belægning for at lokalisere den rigtige jugularvene. Dette opnås bedst med sonden orienteret vinkelret på luftrøret og langsomt bevæger den sideværts fra strubehovedet.
4. Aktivér farvedopplertilstanden for at hjælpe med at identificere halsvenen. Den jugulære vene kan skelnes fra halspulsåren ved at demonstrere sammenklappelighed og kontinuerlig, ikke-pulserende strømning.
5. Brug en 18 G kogenål (se materialetabellen) til at få adgang til venen under ultralydsvejledning. Når adgangen er opnået, skal du føre en 0,035 tommer J-spidstråd (se materialetabel) gennem nålen og trække den ind i beholderen. Fjern nålen over ledningen.
6. Træk en forskyllet central linje over ledningen og skub igennem i venen. Sørg for, at ledningen altid er synlig, når den kommer ud af den distale ende af linjen.
   BEMÆRK: Et 5 Fr, to-lumen centralt venekateter (se materialetabel) blev anvendt til forsøgspersoner, der krævede intravenøs adgang over en periode på 1-4 uger.
7. Hvis der er problemer med at føre linjen gennem huden, skal du bruge en skalpel nr. 11 til at skabe et lille 2-4 mm snit for at lette passagen af linjen over ledningen. Påfør undertryk efterfulgt af en skylning på hver ekstern linje for at sikre tålmodighed. Klem hver linje af.
8. Fastgør de medfølgende ankre til de udvendige linjer og fastgør dem på plads med 2-0 eller 3-0 ikke-opløselige suturer (se materialetabel). Placer yderligere suturer for at sikre de ydre linjer dorsalt for at undgå, at dyret tygger på dem.
9. Fastgør skyllede forlængerledninger til de udvendige kateterlinjer, og spænd dem fast.
10. Sæt dyret på med en kommerciel svinejakke (se Materialeoversigt) og fastgør linjerne indeni. Hvis der endnu ikke skal udføres andre procedurer under samme bedøvelse, skal du montere jakken lige før dyrets restitution.

4. Myokardieinfarkt

BEMÆRK: Dyr anvendt i denne model fik et myokardieinfarkt efter en tidligere offentliggjort metode⁷.

1. Udfør myokardieinfarkt 2 uger før transepikardie- og transendokardieinjektionsprocedurer ^8,9,10. Osmotisk minipumpeimplantation blev udført umiddelbart efter koronar reperfusion inden for samme procedure.

5. Administration af lægemidler eller celler

1. Thoracotomi og epikardiecelleinjektion
   1. Administrer intravenøse profylaktiske antibiotika i form af 22 mg/kg cefazolin (se materialetabel). Fortsæt hvert 90. minut under hele proceduren.
   2. Placer dyret i højre laterale liggende position.
   3. Påfør et fentanylplaster på 100 μg/t (se materialetabel) på det flade plan bag grisens ører. Dæk med en klæbende dressing eller 2-0 sutur.
      BEMÆRK: Dette plaster betragtes som 'aktivt' 12 timer efter placering og giver smertestillende i 72 timer.
   4. Opsæt det elektroanatomiske kortlægningssystem, kabler og patches efter produktspecifikationerne (se materialetabel).
   5. Marker en 10 cm vandret linje mellem ribben 4 og 5 på dyret med en farveblyant eller kirurgisk markør.
   6. Forbered en blanding af lidokain (2 mg/kg) og bupivacain (1 mg/kg) i en enkelt sprøjte med en 25 G kanyle.
   7. Aseptisk forberede det kirurgiske sted og drapere dyret. Udfør en kutan linjeblok på det markerede snitsted ved at stikke kanylen ind i huden i en lav vinkel, trække stemplet lidt ud for at sikre, at der ikke strømmer blod tilbage i sprøjten, og langsomt injicere opløsningen, når nålen trækkes ud af huden. Gentag denne proces, mens du bevæger dig ned ad linjen.
      BEMÆRK: Der skal påføres undertryk på sprøjten på hvert nyt injektionssted for at sikre, at bupivacain ikke administreres intravaskulært. Intravaskulær bupivacain kan hurtigt være dødelig.
   8. Brug en skalpel nr. 22 til at lave et 10 cm hudsnit langs den markerede linje.
   9. Brug monopolar cautery (se materialetabel) til at uddybe snittet gennem de underliggende muskellag, indtil de interkostale muskler er nået.
   10. Klargør en steril sprøjte med 0,5 mg/kg bupivacain og 1 mg/kg lignocain, og sæt en 25 G kanyle på.
   11. Indsæt nålen i en lav vinkel på den kaudale kant af det fjerde ribben. Tryk underpå stemplet for at sikre, at nålen ikke er passeret gennem den interkostale vene eller arterie. Injicer langsomt en fjerdedel af sprøjtens volumen, mens nålen holdes stille.
   12. Gentag trin 5.1.12 yderligere tre steder, 3-5 cm fra hinanden langs den kaudale kant af det fjerde ribben.
   13. Brug Metzenbaum-saksen (se materialetabellen) til at skære de interkostale muskler omhyggeligt, og skær derefter lungehinden efter bekræftelse hos anæstesilægen.
   14. Når lungehinden er indskåret, slukke ventilatoren for at lade lungerne falde væk fra lungehinden. Når snittet er foretaget, tændes ventilatoren igen, og det positive slutekspiratoriske tryk justeres til 4 cmH₂O.
   15. Placer selvbevarende ribben retraktorer mellem ribbenene og åbn langsomt for at udsætte hjertet. Brug vævspincet, tag forsigtigt fat i hjertesækken og skær med Metzenbaum-saksen, så hjertet kan udøves.
       BEMÆRK: Under dette trin og de næste par trin er arytmier almindelige. EKG skal overvåges nøje, og enhver hjertemanipulation skal stoppes midlertidigt, hvis dyret bliver hæmodynamisk ustabilt (gennemsnitligt arterielt tryk under 55 mmHg). Intravenøse boluser af metaraminol (0,25 mg) skal administreres efter behov for at forbedre blodtrykket.
   16. Placer midlertidige 2-0 opholdssuturer i begge ender og sider af perikardiesnittet for at fastgøre det til brystvæggen og skabe en perikardiebrønd. Sørg for, at siderne af perikardiet understøttes for at gøre perikardiebrønden så lav som muligt.
   17. Brug fugtede vatpinde eller laparotomi svampe til at pakke regionen omkring hjertet. Dette vil hjælpe med at holde hjertet stabilt og forhindre tørring af udsatte væv.
   18. Lever toppen af hjertet indefra perikardiehulen med en pegefinger bag venstre ventrikel. Pas på at minimere kompression af venstre ventrikel.
       BEMÆRK: Et sundt hjerte kan slå komfortabelt med toppen pegende lodret og sidde på basen med blid støtte, men ingen kompression. Der er et indledende fald i blodtrykket forbundet med manipulationen, men dette skal komme sig til et acceptabelt niveau i fravær af ekstern ventrikulær kompression.
       1. Hvis der ikke forekommer nogen eller meget træg genopretning i 15 s, skal du straks returnere hjertet til perikardiehulen og tage de nødvendige skridt til at forbedre hæmodynamiske parametre inden yderligere dislokation.
          BEMÆRK: Hvis ventriklen kan forskydes, kan placeringen af toppen uden for perikardiet opretholdes ved at placere gasbindpakninger i passende størrelse inden for perikardiet for at understøtte ventriklen. Ligeledes kan en langstrakt, fugtet vatpind placeres under bunden af hjertet, hvor den fungerer som en 'slynge', der leder hjertespidsen opad mod snittet (figur 1A).
   19. Opret et elektroanatomisk spændingskort over den venstre ventrikulære epikardieoverflade ved hjælp af et elektrofysiologisk kortlægningskateter (figur 1B). Identificer ar-, kant- og fjernzoner ved hjælp af standardspændingsafbrydelser.
       BEMÆRK: Ar og fjernzone blev defineret med bipolære afskæringer på <0,5 mV eller >1,5 mV og unipolære afskæringer på henholdsvis <3 mV eller >8,3 mV^11,12.
   20. Bøj kanylen på den terapeutiske doseringssprøjte på 27 G til en vinkel på ca. 80-90°.
   21. Før kanylen ind i målvævet i en lav vinkel, og tryk på sprøjtestemplet for at udlede 1/4 til 1/3 af det totale volumen. Blanchering af vævet skal overholdes (figur 1C). Brug det elektrofysiologiske kortlægningskateter til at annotere injektionsstedets placering på det genererede epikardiespændingskort (figur 1D).
       BEMÆRK: Køretøjsinjektioner bestående af cellekulturmediet (RPMI 1640) blev brugt til demonstrationsformål i videoprotokollen.
   22. Træk nålen delvist ud og omdirigere den inden for myokardiet. Udled yderligere 1/4 til 1/3 af sprøjtens volumen. Fortsæt, indtil sprøjten er tom.
   23. Gentag trin 5.1.20-5.1.24, indtil den ønskede dosis er givet.
   24. Fjern vatpindene, der pakker hjertet af, og fjern forsigtigt 'slyngen' under hjertet, så den vender tilbage til neutral position. Arytmier er almindelige under dette trin, og der skal udvises forsigtighed som beskrevet i trin 5.1.17.
   25. Fjern 2-0 opholdssuturerne fra hjertesækken. Løsn retraktoren og fjern den fra brystkassen.
   26. Brug størrelse 1 polydioxanon suturer (PDS) med en stump spids, rund nål til at lukke thorax ved at føre den gennem mellemrummet mellem ribben 3 og 4 og ribben 5 og 6.
       BEMÆRK: Smalle figur otte suturer giver en remskiveeffekt til tilnærmelse af ribbenene. To eller tre sådanne suturer skal anvendes, afhængigt af dyrets størrelse.
   27. Før du strammer og binder de ribben-tilnærmelsesvise suturer, skal du indsætte en kort længde silikonerør i snittets ventrale kant.
   28. Anbring den frie ende af slangen i en skål med sterilt saltvand til undervandsforseglet dræning af pleurhulen.
   29. Luk de overliggende muskellag i et simpelt kontinuerligt mønster med 2-0 absorberbare suturer. Luk huden i et simpelt kontinuerligt eller ford sammenlåsende mønster¹³ med en 2-0 eller 3-0 ikke-absorberbar sutur.
   30. Når sårlukningen er afsluttet, udvises den frie luft fra brystkassen ved hjælp af ventilation med positivt tryk.
       1. Tænd for ventilatoren til indstillingen 'fri vejrtrækning'. Brug reservoirposen på rebreathing-kredsløbet til at give et ensartet overtryk til luftvejene (hold ved 20-30 cmH₂O).
       2. Fortsæt dette tryk, indtil der ikke længere observeres bobler i saltskålen, hvilket indikerer, at der ikke er fri luft i brystkassen.
       3. Fjern silikonerøret.
   31. Påfør en klæbende bandage på det kirurgiske sted, og placer spredte enkle afbrudte suturer for at hjælpe med at holde bandagen på plads.
   32. Ved genfinding administreres 0,3 mg/kg metadon subkutant og 0,2-0,5 mg/kg ondansetron (se materialetabel) intravenøst.
2. Jugular vene osmotisk minipump implantation
   1. Dyret anbringes som beskrevet i trin 3.1. Aseptisk forberede og drapere højre side af dyrets hals.
   2. Brug et skalpelblad nr. 22 til at lave et snit på 8-10 cm, der strækker sig kranielt fra et punkt 2-3 cm lateralt til manubrium sterni. Dette snit skal blive lidt mere lateralt, da det bevæger sig kranielt.
   3. Brug Metzenbaum saks til at dissekere gennem kutane colli, sternohyoideus og sternocephalicus muskler. Brug stump dissektion teknikker til at uddybe snittet, indtil den ydre jugular vene er synlig.
   4. Placer selvbevarende retraktorer i snittet, og åbn dem for at forbedre synligheden.
   5. Brug Adson brunvævspincet (se materialetabel) og Metzenbaum-saks til at fjerne blødt væv, der omgiver halsvenen, både over og under (figur 2A). Dette er et afgørende skridt, da blødt væv, der ligger over beholderen, i senere stadier kan hindre minipumpeslangens passage.
   6. Brug en 5-0 absorberbar sutur gennem den kaudale udsatte ende af venen, ca. 1 cm kranial fra den mest kaudale synlige kant af beholderen. Suturen afleveres i 5 mm 'bid' på følgende måde: kranial-til-kaudal på højre side, højre mod venstre og kaudal-til-kranial på venstre side. Det resulterende mønster skal fremstå som 'tre sider af en firkant'. Sørg for, at suturhalerne fra begge ender er lige lange.
   7. Saml minipumpen som beskrevet i brugsanvisningen til produktet (se materialetabellen).
   8. Bind sløjfe elastiske vaskulære bånd omkring karret i både kraniale og kaudale ender. Hold disse løse i starten. Få en assistent til at placere spændinger på de vaskulære bånd for at okkludere karret.
   9. Ved hjælp af en 14 G-nål dannes en punktering i venen i midten af den »tresidede firkant« skabt med suturmateriale (trin 5.2.7; Figur 2B).
   10. Træk minipumpeslangen ind i punkteringen. Det skal let passere ind i fartøjet. Hvis der opstår modstand, skal du ikke fortsætte med at skubbe; Træk i stedet slangen ud, og prøv igen.
   11. Fremfør slangen, indtil der er 1-2 cm tilbage uden for beholderen. Stram suturmaterialet omkring kateterslangen og bind det af i en simpel afbrudt knude. Få assistenten til at frigive og fjerne de vaskulære bånd.
   12. Sæt en 2-0 ikke-absorberbar sutur rundt om minipumpehuset flere gange og bind af, så suturen er sikker på pumpen. Fastgør derefter pumpen til det nærliggende bløde væv med en simpel afbrudt knude (figur 2C, D).
   13. Fjern retraktorerne fra snittet. Luk snittet i en standard tre-lags simpel kontinuerlig lukning.
   14. Administrer 0,2 mg/kg meloxicam subkutant under restitution.
3. Perkutan transendokardial injektion
   1. Placer dyret i dorsal liggende med forben og bagben forlænget og fastgør med bånd.
   2. Aseptisk forberede dyrets kaudale mave og mediale lår. Drape dyret med en fenestreret femoral angiografi drapering (se tabel over materialer).
   3. Opsæt det elektroanatomiske kortlægningssystem, kabler og patches efter produktspecifikationerne (se materialetabel).
   4. Brug en lineær ultralydssonde til at identificere lårbensarterien. Under ultralydsvejledning punkteres lårbensarterien med en kogenål og tråder en 0,035 tommer guidewire ind i karret via nålen. Fjern nålen over ledningen.
   5. Tråd en 8 Fr arteriel kappe og introducer over arterieledningen og skub igennem, indtil kun navet er udsat for huden. Sørg for, at ledningen altid er synlig og kommer ud af kappens nav.
      BEMÆRK: Da dette er en større kappe, kan det lejlighedsvis være nødvendigt med en skalpel nr. 11 for at skabe et lille hudsnit for at lette passagen.
   6. Fjern kappeindføringen og ledningen. Administrer intravenøs heparin (100-200 enheder / kg).
   7. Indfør transendokardial injektionskateter gennem kappen og gå videre til venstre ventrikel via en retrograd aortatilgang.
   8. Opret et elektroanatomisk kort over venstre ventrikel ved forsigtigt at trække kateteret over endokardieoverfladen. Udfør aksial rotation og blide ændringer af spidsbøjningen for at opnå god endokardiekontakt. Identificer ar-, grænse- og fjerntliggende zoner ved hjælp af standardspændingsafbrydelser.
   9. Ret kateteret med fluoroskopisk og elektroanatomisk vejledning til det foretrukne injektionssted. Udfør blid aksial rotation med afbøjning af den distale spids for at engagere og opretholde stabil endokardiekontakt.
   10. Bekræft placeringen af kateterspidsen med mindst to fluoroskopiske afbildninger. Kernekateteret rykkes forsigtigt frem, og nålen forlænges derefter til en kontrolleret intramyokardiedybde (3,5 mm til apikal injektion, 5 mm til septal injektion).
   11. 4-6 ml jodholdig kontrast (se materialetabel) skylles gennem injektionskateteret, indtil det er synligt ved fluoroskopi. Overhold kontrasten i de næste 10-30 s for at sikre, at den forbliver i vævet (figur 3A).
   12. Overhold EKG nøje under forlængelsen af nålen og injektionen, da kørsler af ventrikulær ektopi er almindelige.
       BEMÆRK: Ventrikulær ektopi er, når nålespidsen er kommet i myokardiekontakt.
   13. Hvis kontrastinjektionen er vellykket, skal du følge op med en injektion af det pågældende middel. Skyl dette igennem med kontrast, indtil det observeres fluoroskopisk.
       BEMÆRK: Agenten af interesse er specifik for brugeren, afhængigt af hvilken terapi de tester.
   14. Træk nålen tilbage. Fjern injektionskateteret fra arteriekappen.
   15. Fjern arteriekappen og tryk på stederne i op til 20 minutter, indtil hæmostase er opnået.

6. Generel bedøvelsesgenvinding

1. Sluk for brug af inhalationsanæstesi- eller intravenøse anæstesipumper. Reducer respirationsfrekvensen på ventilatoren til 8-10 vejrtrækninger / min.
2. Efter 2-5 minutter skiftes ventilatoren til 'fri vejrtrækning' tilstand i højst 30 s ad gangen. Overhold dyret og kapnografen for spontan vejrtrækning.
3. Hvis der er opstået spontan vejrtrækning, skal du lade ventilatoren være slukket. Hvis dyret er apnøisk, skal du tænde ventilatoren igen i yderligere 1-2 minutter og prøve igen, indtil spontan vejrtrækning er opnået.
   BEMÆRK: Tidsrammen for genopretning varierer afhængigt af proceduremæssige og dyreegenskaber, men kan variere fra 15 min til 1 time.
4. Når dyret trækker vejret behageligt (respirationsfrekvens på 15-30 vejrtrækninger / min, slutvandskuldioxid mindre end 60, SpO2 over 95%), frakobl ilten, så anden overvågning er tilsluttet.
5. Fjern midlertidige steder med vaskulær adgang, og anvend tryk for at forhindre hæmatomdannelse. Hvis dyret forbliver stabilt og fortsætter med at ilte godt i løbet af de følgende 5 minutter, kan det transporteres til dets genopretningsområde.
6. Efter tre på hinanden følgende spontane svaler tømmes manchetten på endotrachealrøret og fjernes forsigtigt røret.
7. Overvåg dyret i mindst yderligere 5 minutter for at sikre, at de fortsætter med at ilte korrekt og ikke støder på åndedrætsbesvær. Oxygengennemstrømning skal anvendes efter behov, hvis et dyr afmættes efter ekstubation.

Thoracotomi og epikardiecelleinjektion
Af de 29 dyr, der gennemgik thoracotomi og epikardieinjektion, overlevede 26. Histologisk analyse bekræftede indkapsling af humane celler leveret ved denne metode i alle overlevende dyr (figur 1E). Et dyr oplevede dødelige arytmier under celleinjektion og kunne ikke genoplives. En anden oplevede pulsløs elektrisk aktivitet under lukning og langvarig anvendelse af positivt tryk på luftvejene og kunne ikke genvindes. Et tredje dyr kastede op og fik åndedrætsstop ved ekstubation. Dette dyr kunne ikke genoplives.

To dyr oplevede store komplikationer, men var i stand til at blive genoprettet. Et dyr udviklede ventrikelflimmer under intramyokardieinjektion og var i stand til at genoplives med interne defibrilleringspadler og hjertemassage. Det andet dyr kastede op ved ekstubation og havde et kort åndedrætsstop, men var i stand til hurtigt at blive re-intuberet og komme sig godt. Alle disse hændelser forekom under tidlige eksperimenter med reducerede bivirkninger, efterhånden som teamets erfaring med protokollen steg (tabel 1).

Jugular vene osmotisk minipump implantation
Ingen rapporteret mortalitet eller større komplikationer var forbundet med jugular osmotisk minipumpeimplantation. De fleste af de syv dyr oplevede mild hævelse på operationsstedet inden for de første 24 timer, som forsvandt uden indgreb. ELISA udført på serum på dag 3 efter implantation af pumpen viste pumpens effekt og opnåede en signifikant blodkoncentration af trombocytafledt vækstfaktor-AB human (PDGF-AB) sammenlignet med kontrolpersoner⁷ (figur 2E).

Perkutan transendokardial injektion
I alt 22 dyr fik endokardieinjektioner. Af disse injektioner blev 17 betragtet som "vellykkede", bestemt ved fluorescens eller blækfarvning observeret i målvævet ved post mortem (figur 3B). Der var ingen dødelighed forbundet med denne procedure. Et dyr udviklede et lille volumen perikardial effusion fra højre ventrikulær perforering. Dette var selvbegrænsende og resulterede ikke i kardiovaskulært kompromis. Det samme dyr døde; Dette var imidlertid fra en ikke-relateret yderligere procedure efter intramyokardieinjektionen.

Figur 1: Transepikardial kardiomyocytinjektion muliggør direkte hjertevisualisering og opnår en høj andel levedygtige celler leveret til myokardiet. (A) Hjertespidsen udsættes gennem en fugtet gazeslynge, der føres under hjertets bund. (B) Et epikardial kortlægningskateter afgrænser ar- og grænsezoner og kommenterer injektionssteder. (C) En 31 G nål bruges til transepikardialt at injicere celler i myokardiet. (D) Epikardiespændingskort med annotering på injektionsstedet. Lilla: normal spænding, sundt myokardium; Rød: unormal spænding, syg myokardium; Grå prikker: injektionssteder. Efter ofring opsamles hjertet og formalinfikseres til nedstrøms histologisk vurdering. I (E) påvises indpodede humane celler ved immunfarvning for det humane antinukleare antistof, Ku80, og et anti-GFP-antistof. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Indsættelse af jugular veneminipump giver en sikker og pålidelig metode til PDGF-levering over en periode på 7 dage . (A) Den højre halsvene eksponeres, og blødt væv ryddes væk fra beholderen. (B) Vaskulære bånd blokerer beholderen, mens en 14 G nål bruges til at lave en punktering, hvorigennem minipumpeslangen gevind. (C) Minipumpeslangen føres ind i venen, og minipumpehuset fastgøres til tilstødende blødt væv. D) Minipumpehuset og slangen før implantation. E) Serumkoncentrationen af det rekombinante protein, der blev leveret via minipumpen og PDGF-AB, blev målt ved hjælp af ELISA fra hvert dyr på dag 3 efter implantationen. Dyr, der fik PDGF-AB, viste sig at have en signifikant højere blodkoncentration af PDGF-AB end kontroldyr, hvilket bekræftede effekten af den osmotiske minipumpeadministrationsmetode. **angiver en statistisk signifikant forskel mellem grupper (p = 0,005, Mann-Whitney U-test) Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Transendokardial intramyokardieinjektion muliggør en minimalt invasiv terapeutisk administrationsmetode. (A) Et højre forreste skråt fluoroskopisk billede, der viser injektionskateteret (hvid pil), der administrerer kontrastmateriale (gul pil) i myokardiet. Injektionen af kontrastmaterialet både går forud for og følger terapeutisk injektion, så nålens placering i myokardiet kan bekræftes. (B) Den injicerede vektor udtrykte grønt fluorescerende protein (GFP), således at injiceret materiale ville fluorescere ved vævsindsamling, hvilket bekræftede injektionens succes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over komplikationer.

Transepikardial intramyokardieinjektion
Denne procedure har fordelen ved direkte hjertevisualisering og har vist sig at give større lokal retention af terapi end systemiske administrationsmetoder 9,10,14. Imidlertid er thoracotomier invasive, kræver betydelig teknisk dygtighed og udgør en større risiko for sygelighed og dødelighed end andre metoder, der diskuteres^10,15. Kendskab til de kritiske og usikre faser af proceduren kan bidrage til at afhjælpe denne øgede risiko.

Der skal udvises stor omhu ved manipulation af hjertet for at udsætte hjertespidsen på grund af den store risiko for arytmi og tilhørende hæmodynamisk kompromis. Kontinuerlig invasiv blodtryksovervågning og elektrokardiografi muliggør hurtig identifikation af hypotension eller ustabile arytmier, hvilket letter hurtig indgriben og korrektion. Forbigående hypotension kan generelt behandles med metaraminolboluser. Vedvarende hypotension kan midlertidigt indstilles ved at reducere inhalationsbedøvelse (omhyggelig overvågning af anæstesidybden) og påbegynde en vasopressorinfusion, samtidig med at årsagen til ændret hæmodynamik bestemmes. Ustabile arytmier, såsom ventrikulær takykardi eller ventrikelflimmer, kan behandles ved elektrisk kardioversion med eller uden intravenøs antiarytmika.

Lige så vigtigt for dyrs overlevelse er den vellykkede fjernelse af fri gas fra pleurhulen, inden brystet lukkes. Undladelse af at gøre det kan kulminere i at udvikle en pneumothorax, hvilket efterlader dyret i stor risiko for åndedrætsbesvær og død, når det er afbrudt fra den mekaniske ventilator ved genopretning. Det positive luftvejstryk skal opretholdes i mindst 30 s, indtil der ikke længere observeres bobler. Silikoneslangen fjernes straks ved ophør af boblende, og brystkassen lukkes derefter hurtigt. Det er også muligt kirurgisk at placere et thoracostomirør ved lukning, hvilket tillader manuel fjernelse af luft og inflammatorisk væske i løbet af de næste 24-72 timer. Dette er dog svært at holde rent og intakt, især hvis dyrene er anbragt sammen. Skader eller forurening af røret kan føre til pyothorax, pneumothorax eller sepsis. Det er vores erfaring, at det ikke er nødvendigt at indsætte et midlertidigt brystdræn, hvis fri gas fjernes tilstrækkeligt inden lukning af brystet.

Perkutan transendokardial intramyokardieinjektion
Denne metode til terapeutisk administration har den fordel, at den giver mulighed for lokal vævstilførsel med lavere risiko på grund af dens mindre invasive karakter sammenlignet med en kirurgisk tilgang^10,14. Denne teknik anvendes allerede i store dyreforsøg, med både fluoroskopi og elektromekanisk kortlægning som vejledning i fravær af direkte visualisering^10,16,17.

Da hjertet ikke er under direkte syn, er det klogt for proceduralisten at bruge ortogonale fluoroskopiske synspunkter, når de vælger et injektionssted. Desuden er injektionen af fortyndet jodkontrast før og levering af den terapeutiske yderst værdifuld til bekræftelse af myokardiekontakt. Passende kontakt kan bekræftes ved at observere en karakteristisk 'myokardierødme', som kan være en af de eneste markører for injektionssucces før vævshøst. På grund af risikoen for kammerperforering anbefales det også, at tykkelsen på myokardievæggen på det valgte injektionssted er større end 9 mm^14,16.

Jugular venøs osmotisk minipumpe
Den osmotiske minipumpe er en populær enhed, der almindeligvis anvendes i smådyrsforsøg. Der har været stigende interesse for at bruge denne enhed i store dyremodeller 7,18,19 i betragtning af dens unikke fordel ved at administrere et terapeutisk middel med en ensartet hastighed over en bestemt tidsperiode. En mulig begrænsning af denne metode er manglende evne til at ændre eller stoppe infusionshastigheden af lægemidlet uden at udskifte eller fjerne pumpen. Dette bør overvejes, før behandling på denne måde afprøves.

Denne undersøgelse viste, at denne metode kunne udføres med en høj succesrate hos svin, med lav sygelighed og dødelighed. Det skal bemærkes, at mange vitale strukturer støder op til det kirurgiske sted, herunder lymfeknuder, thymus og halspulsåren. Overholdelse af metoden og høring af anatomiske tekster²⁰ anbefales kraftigt for at forhindre utilsigtet skade på nogen af disse strukturer. Den mest bekymrende komplikation ved denne metode er hæmoragisk chok på grund af utilsigtet skade på halsvenen eller en omgivende struktur. Det er derfor afgørende, at det bløde væv, der omgiver halsvenen, fjernes omhyggeligt. Hvis dette trin ikke udføres korrekt, kan det medføre problemer med at placere minipumpeslangen eller kontrollere utilsigtet blødning.

Denne artikel har beskrevet tre metoder til levering af kardioaktive terapi. På trods af den rapporterede succes med hver teknik er der iboende begrænsninger, der skal overvejes. Invasive procedurer (transepikardieinjektion) giver mulighed for øget nøjagtighed af terapeutisk levering; De medfører dog en større risiko for potentielt dødelige komplikationer. Desuden har invasiv levering et større krav til tekniske færdigheder for at minimere risikoen for komplikationer. På samme måde kræver fluoroskopisk styret, transendokardial injektion en grad af teknisk færdighed til kateterisering og manipulation af hardware. Hvis denne metode udføres forkert, er injektionssvigt og dødelige komplikationer mulige.

De beskrevne metoder til direkte injektion giver mulighed for engangsindgivelse af et terapeutisk middel i målvævet. Den jugulære venøse osmotiske minipumpe muliggør systemisk administration af en terapeutisk over en periode på 7 dage. Til sammenligning er denne metode enklere og forbundet med mindre risiko, men den er afhængig af en systemisk terapeutisk at finde vej til myokardiet. Når pumpen først er på plads, er det desuden umuligt at afbryde administrationen eller ændre dosishastigheden uden at bedøve dyret igen og fjerne pumpen.

Alle metoder beskrevet i denne artikel blev udført på dyr på dagen eller 2 uger efter myokardieinfarkt. Derfor kan dette arbejde ikke rapportere succesen med nævnte metoder hos raske dyr eller dyr, der udsættes for en alternativ hjertepatologi. Endelig skal farmakologien og bioteknologien af ethvert bestemt agens overvejes nøje, da dette vil være uløseligt forbundet med effektiviteten af den valgte indgivelsesvej. En detaljeret diskussion af dette ligger uden for rammerne af dette manuskript.

Omfattende skildringer af prækliniske metoder gavner dyrevelfærden og det bredere videnskabelige samfund. Den deraf følgende forbedrede reproducerbarhed af forsøg og resultater fører til færre dyresundhedskomplikationer, reduceret antal dyr, der kræves for at producere signifikante resultater, og større tillid til forsøgsresultater^21,22. Tre metoder til administration af nye lægemidler er beskrevet i denne artikel til behandling af myokardieinfarkt i en svinemodel. Ved at specificere de anvendte teknikker og artikulere fordele og risici ved hver forventes det, at forskere komfortabelt vil være i stand til at skabe konsistente og pålidelige prækliniske modeller, der passer til deres forskningsmål.