Aus dem Darm stammende mikrobielle Metaboliten haben vielfältige Wirkungen, die zu komplexem Verhalten bei Tieren führen. Unser Ziel ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm im Gehirn über die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung über eine Führungskanüle zu beschreiben.
Der Einfluss der Darmmikrobiota und ihrer Metaboliten auf die Physiologie und das Verhalten des Wirts wurde in diesem Jahrzehnt umfassend untersucht. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Darmmikrobiota-abgeleitete Metaboliten hirnvermittelte physiologische Funktionen durch komplizierte Darm-Hirn-Bahnen im Wirt modulieren. Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die wichtigsten bakteriellen Metaboliten, die während der Ballaststofffermentation durch das Darmmikrobiom produziert werden. Sekretierte SCFAs aus dem Darm können an mehreren Stellen in der Peripherie wirken und die Immun-, endokrinen und neuronalen Reaktionen aufgrund der großen Verteilung von SCFAs-Rezeptoren beeinflussen. Daher ist es schwierig, die zentralen und peripheren Wirkungen von SCFAs durch orale und intraperitoneale Verabreichung von SCFAs zu unterscheiden. Dieser Artikel stellt eine videobasierte Methode vor, um die funktionelle Rolle von SCFAs im Gehirn über eine Führungskanüle in frei beweglichen Mäusen zu hinterfragen. Die Menge und Art der SCFAs im Gehirn kann durch Kontrolle des Infusionsvolumens und der Infusionsrate eingestellt werden. Diese Methode kann Wissenschaftlern eine Möglichkeit bieten, die Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu schätzen.
Der menschliche Magen-Darm-Trakt beherbergt verschiedene Mikroorganismen, die auf den Wirt 1,2,3 einwirken. Diese Darmbakterien können Darmmetaboliten während ihrer Verwendung von Nahrungsbestandteilen absondern, die vom Wirt verbrauchtwerden 4,5. Interessanterweise können die Darmmetaboliten, die nicht in der Peripherie metabolisiert werden, über den Kreislauf zu anderen Organen transportiertwerden 6. Bemerkenswert ist, dass diese sezernierten Metaboliten als Mediatoren für die Darm-Hirn-Achse dienen können, definiert als die bidirektionale Kommunikation zwischen dem zentralen Nervensystem und dem Darm7. Frühere Studien haben gezeigt, dass Darmmetaboliten komplexes Verhalten und Emotionen bei Tieren modulieren können 8,9,10,11.
Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind die Hauptmetaboliten, die von Darmmikrobiota während der Fermentation von Ballaststoffen und unverdaulichen Kohlenhydraten produziertwerden 6. Acetat, Propionat und Butyrat sind die häufigsten SCFAs im Darm12. SCFAs dienen als Energiequelle für Zellen im Magen-Darm-Trakt. Nicht metabolisierte SCFAs im Darm können durch die Pfortader zum Gehirn transportiert werden, wodurch Gehirn und Verhalten moduliertwerden 6,12. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCFAs eine entscheidende Rolle bei neuropsychiatrischen Störungen spielen könnten 6,12. Zum Beispiel rettete die intraperitoneale Injektion von Butyrat in BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) Mäusen, einem Tiermodell der Autismus-Spektrum-Störung (ASD), ihre sozialen Defizite13. Mit Antibiotika behandelte Ratten, die Mikrobiota von depressiven Probanden erhielten, zeigten eine Zunahme von angstähnlichen Verhaltensweisen und fäkalen SCFAs14. Klinisch wurden Veränderungen der fäkalen SCFAs-Spiegel bei Menschen mit ASD im Vergleich zu typischerweise entwickelnden Kontrollen beobachtet15,16. Menschen mit Depressionen haben niedrigere fäkale SCFAs-Werte als gesunde Probanden17,18. Diese Studien deuteten darauf hin, dass SCFAs das Verhalten von Tieren und Menschen auf verschiedenen Wegen verändern können.
Mikrobielle Metaboliten üben vielfältige Wirkungen auf mehrere Stellen im Körper aus und beeinflussen die Physiologie und das Verhalten des Wirts 4,19, einschließlich des Magen-Darm-Trakts, des Vagusnervs und des Sympathikus. Es ist schwierig, die genaue Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn zu bestimmen, wenn die Metaboliten über periphere Wege verabreicht werden. Dieser Artikel stellt ein videobasiertes Protokoll vor, um die Auswirkungen von Darmmetaboliten im Gehirn einer sich frei bewegenden Maus zu untersuchen (Abbildung 1). Wir haben gezeigt, dass SCFAs während Verhaltenstests akut durch die Führungskanüle verabreicht werden können. Die Art, das Volumen und die Infusionsrate der Metaboliten können je nach Zweck modifiziert werden. Der Ort der Kanülierung kann angepasst werden, um den Einfluss von Darmmetaboliten in einer bestimmten Gehirnregion zu untersuchen. Unser Ziel ist es, Wissenschaftlern eine Methode zur Verfügung zu stellen, um die möglichen Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm auf das Gehirn und das Verhalten zu untersuchen.
Darm-abgeleitete Metaboliten wurden ohne großen präzisen Mechanismus mit hirnvermittelten Erkrankungen in Verbindung gebracht, teilweise aufgrund ihrer multiplen Bindungsstellen im Körper 6,12,24. Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass SCFAs als Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, epigenetische Regulatoren und Quellen für die Energieproduktion an mehreren Stellen im Körper dienen könnten</…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitarbeitern des Laboratory Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) für die Pflege der Tiere. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Prof. Kun-Yen Huang Education Fund der CHENG-HSING Medical Foundation an C.-W.L. unterstützt; die Mittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) in Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) an T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) bis W.-L.W.; und das Higher Education Sprout Project, Ministry of Education to the Headquarters of University Advancement at NCKU to W.-L.W.
Material | |||
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 | Pfizer | n/a | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) | Millipore | AB153-I | |
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile | NEST | 121921LA01 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0.14 g/L |
Chlorhexidine scrub 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
Chlorhexidine solution | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
Commercial dummy | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm |
Commercial guide cannul | RWD Life Science | 62104 | Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm |
Commercial injector | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF: 0.61 g/L |
Dental acrylic | HYGENIC | n/a | |
Fixing screws | RWD Life Science | 62521 | |
Fluoroshield mounting medium with DAPI | Abcam | AB104139 | |
Horse serum | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
Insulin syringes | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
Isoflurane | Panion & BF biotech | DG-4900-250D | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF: 0.19 g/L |
Ketoprofen | Swiss Pharmaceutical | n/a | |
Lidocaine | AstraZeneca | n/a | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0.19 g/L |
Microscope cover slips | MARIENFELD | 101242 | |
Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
Mineral oil light, white NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | ACSF: 7.46 g/L |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | ACSF: 0.18 g/L |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: 1.76 g/L |
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
Neural tracer | Santa Cruz | SC-358883 | FluoroGold |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Polyethylene tube | RWD Life Science | 62329 | OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm |
Puralube Vet (eye) Ointment | Dechra | 12920060 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs: 13.5 mM |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs: 8 mM |
Sodium propionate | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFAs: 5.18 mM |
Stainless guide cannula | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | OD 0.63 mm; Local vendor |
Stainless injector | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor |
Superglue | Krazy Glue | KG94548R | |
Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
Equipment | |||
Cannula holder | RWD Life Science | B485-68217 | |
Ceiling camera | FOSCAM | R2 | |
Digital stereotaxic instruments | Stoelting | 51730D | |
Dissecting microscope | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
Glass Bead Sterilizer | RWD Life Science | RS1501 | |
Heating pad | Stoelting | 53800M | |
Leica microscope | Leica | DM2500 | |
Micro Dissecting Forceps | ROBOZ | RS-5136 | Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length |
Micro Dissecting Scissors | ROBOZ | RS-5918 | 4.5" Angled Sharp |
Microinjection controller | World Precision Instruments (WPI) | MICRO2T | SMARTouch Controller |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
Microliter syringe | Hamilton | 80014 | 10 µL |
Optical Fiber Cold Light with double Fiber | Step | LGY-150 | Local vendor |
Pet trimmer | WAHL | 09962-2018 | |
Vaporiser for Isoflurane | Step | AS-01 | Local vendor |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Software | |||
Animal behavior video tracking software | Noldus | EthoVision | Version: 15.0.1416 |
Leica Application Suite X software | Leica | LASX | Version: 3.7.2.22383 |