Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn
Summary
Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.
Abstract
Das Fehlen einer geeigneten Methode für die iterative Generierung verschiedener Virusvarianten in voller Länge hat die Untersuchung der gerichteten Evolution in RNA-Viren behindert. Durch die Integration einer fehleranfälligen PCR mit vollständigem RNA-Genom und umgekehrter Genetik kann eine zufällige genomweite Substitutionsmutagenese induziert werden. Wir haben eine Methode entwickelt, die diese Technik verwendet, um verschiedene Bibliotheken zu synthetisieren, um virale Mutanten mit Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Diese Methode, die als Full-Length-Mutanten-RNA-Synthese (FL-MRS) bezeichnet wird, bietet die folgenden Vorteile: (i) die Möglichkeit, eine große Bibliothek über eine hocheffiziente, fehleranfällige PCR in einem Schritt zu erstellen; (ii) die Fähigkeit, Gruppen von Bibliotheken mit unterschiedlichem Grad an genetischer Vielfalt zu erstellen, indem die Genauigkeit der DNA-Polymerase manipuliert wird; iii) die Herstellung eines PCR-Produkts in voller Länge, das direkt als Vorlage für die Synthese mutierter RNA dienen kann; und (iv) die Fähigkeit, RNA zu erzeugen, die als nicht selektierter Input-Pool in Wirtszellen eingebracht werden kann, um nach viralen Mutanten des gewünschten Phänotyps zu suchen. Mit Hilfe eines reversen genetischen Ansatzes haben wir herausgefunden, dass FL-MRS ein zuverlässiges Werkzeug ist, um die virale Evolution in allen Stadien des Lebenszyklus des Hepatitis-C-Virus, JFH1-Isolat, zu untersuchen. Diese Technik scheint ein unschätzbares Werkzeug zu sein, um die gerichtete Evolution einzusetzen, um die Anpassung, Replikation und die Rolle viraler Gene in der Pathogenese und antiviralen Resistenz in RNA-Viren mit positivem Sinn zu verstehen.
Introduction
Das vorausschauende genetische Screening beginnt mit einem viralen Phänotyp von Interesse und versucht dann, durch Sequenzierung seines Genoms und Vergleich mit dem des ursprünglichen Stammes, die Mutation(en) zu identifizieren, die diesen Phänotyp verursachen. Im Gegensatz dazu werden bei umgekehrten genetischen Screenings zufällige Mutationen in ein Zielgen eingeführt, gefolgt von einer Untersuchung des resultierenden Phänotyps/der resultierenden Phänotypen1. Für den Ansatz der umgekehrten Genetik ist die In-vitro-Mutagenese die am weitesten verbreitete Technik, um einen Pool von Varianten zu erstellen, die anschließend auf interessante Phänotypen untersucht werden. Es wurden verschiedene genetische Werkzeuge beschrieben, um eine genomweite zufällige Mutagenese von RNA-Viren zu erreichen, darunter die fehleranfällige PCR (ep-PCR)2,3, die zirkuläre Polymerase-Erweiterung4 und die Mu-Transposon-Insertionsmutagenese 5,6,7. Die beiden letztgenannten Methoden liefern Bibliotheken mit begrenzter Sequenzvielfalt und sind anfällig für die Einführung großer Insertionen und Deletionen, die für Viren hochgradig tödlich sind und die Genesung infektiöser Virusvarianten stark einschränken.
ep-PCR ist eine bekannte, leistungsstarke Mutagenesetechnik, die im Protein-Engineering weit verbreitet ist, um mutierte Enzyme für die Auswahl von Phänotypen mit gewünschten Eigenschaften wie verbesserter thermischer Stabilität, Substratspezifität und katalytischer Aktivität zu generieren 8,9,10. Diese Technik ist einfach durchzuführen, da sie eine einfache Ausrüstung erfordert, keine langwierigen Manipulationen erfordert, handelsübliche Reagenzien verwendet und schnell ist. Darüber hinaus generiert es qualitativ hochwertige Bibliotheken.
Hier haben wir eine neuartige Methode zur Synthese von Mutanten-RNAs (FL-MRS) entwickelt, um vollständige Genome des Hepatitis-C-Virus (HCV) durch Integration von ep-PCR zu generieren, die eine zufällige genomweite Substitutionsmutagenese und umgekehrte Genetik induziert. Selbst die Insertion oder Deletion eines einzelnen Nukleotids ist für Positiv-Sense-RNA-Viren ([+]ssRNA) höchst schädlich; Daher ist die PCR-basierte Substitutionsmutagenese die bevorzugte Methode zur iterativen Generierung großer, vielfältiger Bibliotheken von vollständigen (+)ss-RNA-Virusgenomen mit guter Viabilität.
FL-MRS ist ein unkomplizierter Ansatz, der durch das sorgfältige Design eines Primer-Sets, das an den viralen cDNA-Klon bindet, auf jedes Positiv-RNA-Virus mit einer Genomlänge von ~10 kb angewendet werden kann. pJFH1 ist ein infektiöser cDNA-Klon, der für den HCV-Genotyp 2a kodiert und alle Schritte des Viruslebenszyklus rekapitulieren kann. Mit Hilfe des FL-MRS-Ansatzes demonstrierten wir die Synthese von zufällig mutagenisierten vollständigen Genombibliotheken (Mutant Libraries [MLs]), um replikationskompetente JFH1-Varianten zu erzeugen, für die es kein Vorwissen über die Eigenschaften gab, die mit Mutationen verbunden sind. Nach der Exposition gegenüber einem antiviralen Mittel überwanden einige der Virusvarianten schnell den Arzneimitteldruck mit der gewünschten phänotypischen Veränderung. Mit dem hier beschriebenen Protokoll kann eine Vielzahl von Virusvarianten erzeugt werden, was Möglichkeiten schafft, die Evolution von (+)ssRNA-Viren zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir ein einfaches und schnelles FL-MRS-Verfahren beschrieben, das ep-PCR18 und reverse Genetik für die Synthese von HCV-Vollgenombibliotheken integriert, die dann in einem Zellkultursystem verwendet werden können, um replikationskompetente Varianten für das Screening von arzneimittelresistenten Phänotypen zu generieren. Die Verwendung der Low-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase ist eine Voraussetzung für die ep-PCR, die den Einbau von Substitutionen während der PCR-Amplifikati…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Department of Biotechnology der indischen Regierung finanziell unterstützt (Fördernummer BT/PR10906/MED/29/860/2014).
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
Referencias
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