Cellekulturteknikker har givet anledning til adskillige fremskridt inden for forskellige områder af cellulær neurofysiologi inden for sundhed og sygdom. Især primære cellekulturer, der er frisk isoleret fra et laboratoriedyrs neuronale væv, giver eksperimentatoren mulighed for nøje at studere forskellige cellers adfærd i forskellige biokemiske medier og fysiologiske opsætninger. Brug af forskellige fluorescerende fysiologiske indikatorer såsom Ca²⁺-følsomme farvestoffer i kombination med time-lapse videomikroskopi giver bedre indsigt i de cellulære biofysiske og biokemiske processer i realtid.

ALS er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der påvirker øvre og nedre motorneuroner¹. Sygdommen har en kompleks patogenese af den familiære type, men for det meste af den sporadiske form (90% af tilfældene)². Det er velkendt, at ikke-celle autonome mekanismer bidrager til ALS patofysiologi, primært på grund af gliaceller³. ALS er også godt karakteriseret som en neuroinflammatorisk sygdom med involvering af humorale og cellulære faktorer af inflammation.

Immunoglobulin G anvendes i vid udstrækning som en molekylær markør i ALS og andre neurodegenerative sygdomme. At studere serumniveauet af denne markør kan indikere tilstedeværelsen og stadiet af neuroinflammation i sygdommen ^4,5,6, mens dets tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brud på blodhjernebarrieren⁷. IgG’er blev også identificeret som aflejringer i rygmarvsmotorneuronerne hos ALS-patienter⁷. Ikke desto mindre har denne tilgang vist nogle uoverensstemmelser i sammenhængen mellem niveauet af IgG’er og sygdommens stadium og egenskaber⁶.

IgG isoleret fra sera af ALS-patienter (ALS IgG) kan inducere et calciumrespons i naive astrocytter⁸ og glutamatfrigivelse i neuroner, hvilket peger på en excitotoksisk virkning – et kendetegn ved ALS-patologi⁹. Undersøgelser af hSOD1^G93A ALS-rottemodellen (indeholdende flere kopier af den humane SOD1-mutation¹⁰) viste imidlertid en række markører for oxidativ stress i dyrkede neuroglialceller¹¹, væv 12,13,14 eller levende dyr ¹³. Det er bemærkelsesværdigt, at astrocytterne dyrket fra ALS-rottemodellen var mere tilbøjelige til oxidativ stress induceret af peroxid end astroglia fra ikke-transgene kuldkammerater¹¹.

Mikroglialceller i kultur påvirkes af ALS IgG på en mindre tilsyneladende måde. En BV-2 mikroglialcellelinje viste nemlig en stigning i signalet fra fluorescerende markører for oxidativ stress som reaktion på anvendelsen af kun 4/11 ALS IgG-patientprøver¹⁵. Det er velkendt, at microglia deltager i mange neuroinflammatoriske patologier, hvilket øger oxidativ stress og sen progressionsfase i den ikke-celle autonome mekanisme af ALS^16,17. Ikke desto mindre viste dataene med ALS IgG’er, at disse celler muligvis ikke er så reaktive som astrocytter til disse humorale faktorer af ALS-inflammation. Flere undersøgelser er blevet udført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke kun hos hvalpe, men også i symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på rygmarven 18,19,20,21. Dette gælder også for mikroglial primære kulturer, men i mindre grad end astrocytter og for det meste fra hjerneområder på fosterstadiet^22,23,24.

Vi bruger time-lapse videobilleddannelse af Ca²⁺ på celler i kultur primært som et middel til at følge intracellulære transienter af denne ion som en fysiologisk markør for excitotoksicitet. Ved biofysisk karakterisering af disse transienter (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således opnå eksperimentelle diagnostiske parametre fra forskellige cellulære modeller af neurodegeneration. Denne teknik giver således en fordel ved en kvantitativ fysiologisk vurdering af IgG’er som sygdomsbiomarkører. Der er en stor mængde litteratur om IgGs og Ca²⁺ rolle i induktionen af ALS. De fleste af disse undersøgelser blev udført ved at inducere ALS ved at injicere patient IgG’er i forsøgsdyr 25,26,27,28,29^, som derefter viste intracellulær Ca ²⁺ elevation og IgG depositioner. En række undersøgelser undersøgte effekten af ALS IgGs på motorsynapsen in vitro^30,31,32. I ovenstående sammenhæng sætter teknikken, der præsenteres her, fokus på gliaceller som vigtige aktører i ALS’s ikke-celleautonome mekanisme og kvantificerer deres potentielle excitotoksiske respons på IgG’er som humorale faktorer for neuroinflammation. Denne tilgang kan have en bredere anvendelse til test af andre humorale faktorer såsom hele sera, CSF eller cytokiner i forskellige cellekultursystemer og i cellulære modeller af generel inflammation.

Dette papir beskriver, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra cortices af Sprague Dawley rotter, og hvordan man yderligere kan bruge disse celler til at studere ALS patofysiologi med patient sera-afledt IgG. Protokoller er detaljerede for farvelægning af dyrkede celler (figur 1) og optagelser af Ca²⁺ ændringer i time-lapse videobilleddannelseseksperimenter. Eksempler på videooptagelser vil vise, hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, hvor sidstnævnte aktiverer purinerge membranreceptorer. Vist for første gang er et eksempel på, hvordan astrocytter isoleret fra hSOD1^G93A ALS rottehjerne reagerer med et mere udtalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller, og hvordan man relaterer denne proces til forskellene i Ca²⁺ butiksdrift. Også vist er et eksempel på calciumbilleddannelse i mikroglialceller, der er akut udfordret med ALS IgG, med kun et beskedent respons af intracellulært calcium.