ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

細胞培養技術は、健康と病気における細胞神経生理学の多様な分野で多くの進歩をもたらしました。特に、実験動物の神経組織から新たに単離された初代細胞培養により、実験者はさまざまな生化学的培地や生理学的設定での多様な細胞の挙動を綿密に研究することができます。^Ca2+感受性色素などのさまざまな蛍光生理学的指標をタイムラプスビデオ顕微鏡と組み合わせて使用 すると、細胞の生物物理学的および生化学的プロセスをリアルタイムでよりよく理解できます。

ALSは、上位および下部の運動ニューロンに影響を与える壊滅的な神経変性疾患です¹。この病気は家族型の複雑な病因を持っていますが、ほとんどが散発的な型です(症例の90%)²。非細胞自律機構がALS病態生理に寄与することはよく知られており、主にグリア細胞の本質的な役割に起因しています³。ALSはまた、炎症の体液性および細胞性因子の関与を伴う神経炎症性疾患としてよく特徴付けられる。

免疫グロブリンGは、ALSやその他の神経変性疾患の分子マーカーとして広く使用されています。このマーカーの血清レベルを研究することは、疾患における神経炎症の存在および病期を示すことができる^4,5,6が、脳脊髄液中のその存在は、血液脳関門7の破れを示すことができる。IgGは、ALS患者の脊髄運動ニューロンにおける沈着物としても同定された⁷。それにもかかわらず、このアプローチは、IgGのレベルと疾患の病期および特徴との相関においていくつかの矛盾を示しています⁶。

ALS患者の血清から単離されたIgG(ALS IgG)は、ナイーブアストロサイト⁸でカルシウム応答を誘導し、ニューロンでグルタミン酸放出を誘発する可能性があり、ALS病理9の特徴である興奮毒性効果^{を示しています。}しかし、hSOD1^G93A ALSラットモデル(ヒトSOD1^変異10の複数のコピーを含む)に関する研究は、培養神経膠細胞¹¹、組織12、13^、14、または生きた動物¹³において酸化ストレスの多くのマーカーを示した。ALSラットモデルから培養されたアストロサイトは、非トランスジェニック同腹仔からのアストログリアよりも過酸化物によって誘発される酸化ストレスを受けやすいことは注目に値します¹¹。

培養中のミクログリア細胞は、あまり明白ではない方法でALS IgGの影響を受けます。すなわち、BV-2ミクログリア細胞株は、わずか4/11 ALS IgG患者試料の適用に応答して酸化ストレスの蛍光マーカーからのシグナルの上昇を示した¹⁵。ミクログリアは多くの神経炎症病理に関与し、ALS^16,17の非細胞自律メカニズムにおける酸化ストレスおよび後期進行期を追加することはよく知られている。それにもかかわらず、ALS IgGのデータは、これらの細胞がALS炎症のこれらの体液性因子に対して星状細胞ほど反応性がない可能性があることを示しました。ALSマウスモデルの初代星状細胞を用いて、仔だけでなく、脳または脊髄上の症候性動物においても、いくつかの研究が行われている18,19,20,21。これはミクログリア初代培養にも当てはまりますが、星状細胞ほどではなく、主に胚期の脳領域からのものです^22,23,24。

培養中の細胞上の^Ca2+のタイムラプスビデオイメージングは、主に興奮毒性の生理学的マーカーとしてこのイオンの細胞内過渡性を追跡する手段として使用しています。したがって、これらの過渡現象(振幅、過渡下面積、立ち上がり時間、周波数)の生物物理学的特性評価により、研究者は神経変性の多様な細胞モデルから実験的診断パラメータを得ることができます。したがって、この技術は、疾患バイオマーカーとしてのIgGの定量的生理学的評価の利点を提供します。ALSの誘導におけるIgGと^Ca2+の役割に関する文献は数多くあります。これらの研究のほとんどは、患者のIgGを実験動物に注射することによってALSを誘導することによって行われ²⁵、²⁶、27、²⁸、^29、その後^、細胞内^Ca2+上昇およびIgG沈着を示した。一連の研究では、in vitroでの運動シナプスに対するALS IgGの効果を調査しました^30,31,32。上記の文脈において、ここで提示された技術は、ALSの非細胞自律メカニズムにおける重要なプレーヤーとしてのグリア細胞に焦点を当て、神経炎症の体液性因子としてのIgGに対する潜在的な興奮毒性応答を定量化します。このアプローチは、さまざまな細胞培養システムや一般的な炎症の細胞モデルで、血清全体、CSF、サイトカインなどの他の体液性因子の試験に幅広い用途がある可能性があります。

この論文では、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、アストロサイト、ミクログリアの初代培養物を調製する方法と、これらの細胞をさらに使用して、患者の血清由来IgGによるALS病態生理学を研究する方法について説明します。培養細胞の色素ローディング(図1)とタイムラプスビデオイメージング実験における^Ca2+変化の記録に関するプロトコルが詳しく説明されています。ビデオ録画の例は、グリア細胞がATPと比較してALS IgGにどのように反応するかを示し、後者はプリン作動性膜受容体を活性化します。hSOD1^G93A ALSラット脳から単離された星状細胞が、非トランスジェニック対照と比較してALS IgGに対するより顕著なCa2+応答とどのように反応するか、およびこのプロセスを^Ca2+保存操作の違いに関連付ける方法の例が初めて示されています。また、ALS IgGに急性挑戦されたミクログリア細胞におけるカルシウムイメージングの例も示されており、細胞内カルシウムの反応はわずかです。