वर्तमान प्रोटोकॉल सायनोबैक्टीरिया संस्कृतियों से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव, एकाग्रता और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत विवरण प्रदान करता है। विभिन्न पैमानों पर संस्कृतियों से पुटिकाओं को शुद्ध करने के लिए दृष्टिकोण, तरीकों के बीच व्यापार-बंद, और क्षेत्र के नमूनों के साथ काम करने के लिए विचारों पर भी चर्चा की जाती है।
साइनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषक, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक विविध समूह है जो वैश्विक पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और आवश्यक जैव प्रौद्योगिकी मॉडल के रूप में कार्य करता है। हाल के काम से पता चला है कि समुद्री और मीठे पानी के सायनोबैक्टीरिया दोनों बाहरी पुटिकाओं का उत्पादन करते हैं – रोगाणुओं की बाहरी सतह से जारी छोटी झिल्ली-बाध्य संरचनाएं। जबकि पुटिकाएं संभवतः विविध जैविक प्रक्रियाओं में योगदान करती हैं, साइनोबैक्टीरिया जीव विज्ञान में उनकी विशिष्ट कार्यात्मक भूमिकाएं काफी हद तक अज्ञात हैं। इस क्षेत्र में अनुसंधान को प्रोत्साहित करने और आगे बढ़ाने के लिए, साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को अलग करने, ध्यान केंद्रित करने और शुद्ध करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वर्तमान कार्य उन तरीकों पर चर्चा करता है जिन्होंने प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस की बड़ी संस्कृतियों से पुटिकाओं को सफलतापूर्वक अलग कर दिया है। इन उपभेदों से पुटिका के नमूनों को परिमाणित करने और विशेषता देने के लिए विधियां प्रस्तुत की गई हैं। जलीय क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने के लिए दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है। अंत में, साइनोबैक्टीरियल पुटिका शुद्धिकरण के साथ सामना की जाने वाली विशिष्ट चुनौतियों, विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पद्धतिगत विचार, और दृष्टिकोणों के बीच व्यापार-बंद पर भी चर्चा की जाती है।
बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) गोलाकार संरचनाएं हैं, जो व्यास में ~ 20-400 एनएम के बीच होती हैं, जो लगभग सभी जीवों द्वारा अपने आसपास के वातावरण 1,2,3 में जारी की जाती हैं। पुटिकाओं को लिपिड बाईलेयर द्वारा सीमांकित किया जाता है और वे खुद को दोहरा नहीं सकते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में, इन संरचनाओं को मुख्य रूप से बाहरी झिल्ली से छोटे भागों के ‘ब्लेबिंग’ द्वारा उत्पन्न माना जाता है। फिर भी, फ्लैगेलर गति, सेल लाइसिस, और आंतरिक और बाहरी झिल्ली सामग्री दोनों के स्राव सहित अन्य प्रक्रियाएं, पुटिकाओं के साथ-साथ 4,5 का उत्पादन कर सकती हैं। ईवी में लिपिड, घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और मेटाबोलाइट्स सहित विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स हो सकते हैं, और इस सामग्री को कोशिकाओं 4,5,6 के बीच परिवहन कर सकते हैं। इन विशेषताओं को देखते हुए, ईवी का अध्ययन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी संभावित भूमिकाओं को समझने के लिए किया जा रहा है, जिसमें सेलुलर संचार, बायोफिल्म गठन, क्षैतिज जीन स्थानांतरण, मेजबान-फेज गतिशीलता और पोषक तत्व विनिमय 4,6 शामिल हैं।
साइनोबैक्टीरिया ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक बड़ा और विविध समूह है, जिसमें एककोशिकीय और फिलामेंटस जीव शामिल हैं। वे कई दृष्टिकोणों से रुचि रखते हैं, जिसमें उनके शरीर विज्ञान और विविधताको समझना शामिल है 7,8, महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र कार्य जो वे 9,10 की सेवा करते हैं, और जैव प्रौद्योगिकी के लिए उनकी उपयोगिता11,12। साइनोबैक्टीरिया विभिन्न प्रकार के आवासों में पाए जाते हैं, या तो समुद्री, मीठे पानी और स्थलीय वातावरण में मुक्त रहने वाले जीवों के रूप में, या काई, फर्न, पौधों के साथ सहजीवी संघों में, या लाइकेन और स्पंजमें 13। वे जलीय पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण प्राथमिक उत्पादकों के रूप में कार्य करते हैं, ऑक्सीजनिक प्रकाश संश्लेषण 9,10 के माध्यम से ऑक्सीजन और कार्बनिक कार्बन का उत्पादन करते हैं, और कुछ वायुमंडलीय नाइट्रोजनको ठीक करने में सक्षम हैं। समुद्री और मीठे पानी के साइनोबैक्टीरिया, जिसमें प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस शामिल हैं, प्रयोगशाला की स्थिति में ईवी का उत्पादन करते हैं 14,15,16, और साइनोबैक्टीरियल पुटिकाएं प्राकृतिक वातावरण में भी पाई जा सकती हैं 14,17। साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के जैविक और पारिस्थितिक कार्य अज्ञात हैं, लेकिन इस क्षेत्र में आगे के शोध से साइनोबैक्टीरियल फिजियोलॉजी, भेदभाव, संचार रणनीतियों, विकास और ट्रॉफिक इंटरैक्शन पर सवालों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की संभावना है। इसके अलावा, बायोमोलेक्यूल्स की विविध श्रेणियों को ले जाने के लिए साइनोबैक्टीरिया ईवी की क्षमता में वाणिज्यिक अनुप्रयोग18,19 हो सकते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने और विशेषता देने के तरीकों का वर्णन करता है ताकि साइनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका जीव विज्ञान की व्यापक परीक्षा को सक्षम और प्रोत्साहित किया जा सके। जबकि यहां वर्णित वर्कफ़्लो अन्य बैक्टीरिया से ईवी को अलग करने और विशेषता देने के लिए प्रोटोकॉल के अनुरूप है, साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों में आमतौर पर कम सेल और पुटिका सांद्रता होती है जो आमतौर पर मेजबान से जुड़े या रोगजनक मॉडल सिस्टम 20,21,22 के साथ देखी जाती है। इस प्रकार, साइनोबैक्टीरिया ईवी के अध्ययन के लिए खेती और पुटिका अलगाव के लिए विशेष विचारों और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो उपभेदों और मीडिया पृष्ठभूमि के बीच आगे भिन्न होते हैं। चूंकि कोई भी एकल प्रोटोकॉल सभी उपभेदों, विकास की स्थिति और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम नहीं करेगा, इसलिए हम कई विकल्प प्रदान करते हैं और इसमें शामिल ट्रेड-ऑफ पर चर्चा करते हैं ताकि शोधकर्ता अपने प्रयोगात्मक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण निर्धारित कर सकें।
सामान्य विचार
प्रोटोकॉल (चित्रा 1) को इस बात पर प्रकाश डालने के लिए विकल्पों के एक सेट के रूप में प्रस्तुत किया गया है कि साइनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के साथ काम करने के लिए कोई ‘एक आकार-फिट-सभी’ विधि नहीं है। इच्छुक शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल के वर्गों का उपयोग कर सकते हैं जो उनके विशेष मॉडल जीव, प्रयोगात्मक प्रश्नों / लक्ष्यों और उपकरण उपलब्धता के लिए संगत और उपयुक्त हैं। सभी पुटिका अलगाव दृष्टिकोण में ट्रेड-ऑफ शामिल हैं और अपरिहार्य रूप से पूर्वाग्रह की कुछ डिग्री में परिणाम होगा। जबकि किसी को जब भी संभव हो इसे कम करने की कोशिश करनी चाहिए, सबसे महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना है कि उपयोग की जाने वाली विस्तृत पद्धति उचित MISEV (एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी) दिशानिर्देशों36 के अनुसार रिपोर्ट की गई है।
संस्कृति विकास
साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों को दुनिया भर में उपलब्ध कई संस्कृति संग्रहों में से एक से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। कुछ उदाहरण Roscoff संस्कृति संग्रह (स्टेशन Biologique de Roscoff, फ्रांस), पाश्चर संस्कृति संग्रह (संस्थान पाश्चर, पेरिस, फ्रांस), और समुद्री शैवाल और माइक्रोबायोटा के लिए Provasoli-Guillard राष्ट्रीय केंद्र (NCMA, मेन, संयुक्त राज्य अमेरिका) हैं। पसंद के साइनोबैक्टीरिया तनाव को उचित माध्यम और पर्यावरणीय स्थितियों में खेती की जानी चाहिए, जो विभिन्न उपभेदों के बीच काफी भिन्न होती है। साइनोबैक्टीरिया की खेती के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मीडिया की एक सूची संस्कृति संग्रह वेबसाइटों या अन्य प्रकाशनों 37,38,39 पर पाई जा सकती है।
साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के साथ काम करना कई विशिष्ट मॉडल प्रयोगशाला हेटरोट्रॉफ़्स के लिए रिपोर्ट किए गए तरीकों की तुलना में कुछ अद्वितीय चुनौतियां प्रस्तुत करता है। साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों में अन्य रोगाणुओं जैसे एस्चेरिचिया कोलाई14,16,40 में पाए जाने वाले लोगों की तुलना में कम परिमाण के आदेशों की पुटिका सांद्रता होती है। ये अंतर, संभवतः कम सेल घनत्व और / या पुटिका उत्पादन दरों से उत्पन्न होते हैं, इसका मतलब है कि अपेक्षाकृत बड़ी संस्कृतियों (~ 1-20 एल या अधिक) को थोक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने के लिए छोटे पैमाने पर संस्कृतियों से पुटिका की पैदावार का परीक्षण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है कि उनके वांछित अंतिम लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए कितनी सामग्री आवश्यक होगी। यह स्थापित करने के महत्व को स्थापित करने के लिए कि क्या प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया में एक पता लगाने योग्य कण पृष्ठभूमि है, किसी भी प्रयोग को शुरू करने से पहले भी जोर देने की आवश्यकता है, क्योंकि वह सामग्री संभावित रूप से पुटिका जनसंख्या परिमाणीकरण को भ्रमित कर सकती है, पुटिका एकाग्रता / आकार माप की संवेदनशीलता को कम कर सकती है, या अंतिम पुटिका तैयारी को दूषित कर सकती है।
क्षेत्र के लिए एक और चुनौती यह है कि सभी साइनोबैक्टीरिया शुद्ध संस्कृति में अच्छी तरह से, या बिल्कुल भी विकसित नहीं होते हैं। जब तक कि एक्सेनिक प्रदान नहीं किया जाता है, भौतिक पुटिका विशेषताओं, उत्पादन दरों, या सामग्री की व्याख्याएं आवश्यक रूप से समुदाय में किसी भी एक तनाव द्वारा उत्पादित पुटिकाओं के बारे में स्पष्ट निष्कर्ष नहीं निकाल सकती हैं। शोधकर्ताओं को यह भी सलाह दी जाती है कि अन्य प्रकार के कण क्या मौजूद हो सकते हैं और विशिष्ट नैनोपार्टिकल विश्लेषण उपकरणों द्वारा पुटिकाओं के साथ संभावित रूप से भ्रमित हो सकते हैं, जो आवश्यक रूप से विभिन्न कण प्रकारों के बीच भेदभाव नहीं कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह सत्यापित करना आवश्यक हो सकता है कि उपयोग किए जा रहे तनाव में एक प्रोफेज का अभाव है, या तो जीनोम अनुक्रमण, प्रेरण assays, या अन्य साधनों के माध्यम से या अन्य प्रकार के कण पदार्थ जारी नहीं करता है। हमारे अनुभव में, अधिकांश साइनोबैक्टीरिया पुटिकाएं व्यास में <0.2 μm हैं, लेकिन जब एक नए तनाव या विकास की स्थिति को देखते हैं, तो किसी को यह पुष्टि करनी चाहिए कि क्या 0.45 μm रंध्र-आकार फिल्टर का उपयोग करने से शुद्ध कणों के आकार वितरण में बदलाव होता है।
संस्कृति की स्थिति के कई पहलू पुटिका उत्पादन और इसकी सामग्री41,42 को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, संस्कृति विकास के लिए उपयोग की जाने वाली भौतिक और रासायनिक स्थितियों (प्रकाश विकिरण, तापमान और मीडिया संरचना सहित) को परिणामों की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए संभव डिग्री तक प्रलेखित और नियंत्रित करने की आवश्यकता है। पुटिका सामग्री के किसी भी रासायनिक विश्लेषण को पृष्ठभूमि संरचना के लिए जिम्मेदार होना चाहिए, खासकर जब ‘-ओमिक्स’ शैली उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण किया जाता है। अपरिभाषित मीडिया का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, जैसे कि प्राकृतिक समुद्री जल पृष्ठभूमि पर आधारित या खमीर निकालने या ट्रिपटोन के साथ पूरक। एक परिभाषित विकास माध्यम का उपयोग करना प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर बेहतर हो सकता है।
शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित अंतराल पर संस्कृति विकास गतिशीलता की सावधानीपूर्वक निगरानी करने की आवश्यकता है कि वे जानते हैं कि विकास के चरण में एक दिए गए बैच संस्कृति कहां है और न केवल समय की एक मनमाने ढंग से राशि के बाद नमूने एकत्र करते हैं। पुटिका संरचना विकास चरणों में भिन्न हो सकती है, विशेष रूप से घातीय और स्थिर चरणों41,42 के बीच। उदाहरण के लिए, स्थिर चरण में नमूना पुटिकाओं का कम से कम कुछ अंश एक अलग सेलुलर तंत्र से उत्पन्न हो सकता है, जैसे कि सेल लाइसिस, जो घातीय विकास के दौरान नहीं होगा। हालांकि यह अभी भी महान जैविक रुचि का हो सकता है, नमूना जानना आवश्यक है। यदि एक साइनोबैक्टीरिया संस्कृति एक ऐसे समय में वांछित विकास चरण तक पहुंचती है जब नमूना एकाग्रता के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव नहीं होता है, तो कोशिकाओं को <0.2 μm अंश से तुरंत अलग करना (सेंट्रीफ्यूजेशन और / या प्रत्यक्ष 0.2 μm निस्पंदन के साथ), और फिर सेल-मुक्त निस्पंदन को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की सिफारिश की जाती है। सामग्री को पुटिकाओं की एकाग्रता या आकार वितरण पर कोई ध्यान देने योग्य प्रभाव नहीं होने के साथ दिनों के लिए इस तरह से संग्रहीत किया जा सकता है।
पुटिका शोधन
महत्वपूर्ण मात्रा संस्कृतियों से पुटिकाओं को अलग करने की लगातार आवश्यकता साइनोबैक्टीरिया पुटिका अलगाव वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण है। सामग्री की बड़ी मात्रा के साथ काम करते समय, पुटिकाओं को डाउनस्ट्रीम पृथक्करण वर्कफ़्लो से पहले केंद्रित करने की आवश्यकता होगी। 100 केडीए की नाममात्र आणविक वजन सीमा के साथ कंसंट्रेटर (स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर झिल्ली या केन्द्रापसारक कॉलम) को आम तौर पर सलाह दी जाती है, क्योंकि वे एकाग्रता समय को उचित रखते हुए कम आणविक वजन के साथ घुलनशील सामग्री से अलग होने की अनुमति देते हैं, लेकिन 30 केडीए फिल्टर भी अक्सर सफलता के साथ उपयोग किए जाते हैं। जबकि पुटिकाओं को शुद्ध करने के कई गैर-अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित तरीके (उदाहरण के लिए, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित सिस्टम, आत्मीयता-कैप्चर तकनीक, और वर्षा-आधारित दृष्टिकोण) बाह्य कोशिकीय पुटिका क्षेत्र में लोकप्रिय हो रहे हैं, हमारे अनुभव में, इन दृष्टिकोणों के परिणामस्वरूप पैदावार में कमी आ सकती है और आमतौर पर आवश्यक संस्कृति वॉल्यूम के साथ असंगत होते हैं।
शोधकर्ताओं को आयोडिक्सनॉल पृष्ठभूमि की संरचना और पुटिका शुद्धिकरण के दौरान उपयोग किए जाने वाले धोने / पुनर्सस्पेंशन बफर की संरचना पर विचार करने की आवश्यकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे वांछित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संगत हैं। कई मामलों में, अंतिम पुटिका नमूने को विकास मीडिया या विकास माध्यम (जैसे, प्राकृतिक बनाम कृत्रिम समुद्री जल) के लिए संरचना में तुलनीय एक परिभाषित बफर में फिर से निलंबित किया जा सकता है। हालांकि, यह समुद्री साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के साथ संभव नहीं हो सकता है, जिसके लिए विश्लेषण के लिए आगे प्रयोगात्मक हेरफेर की आवश्यकता होगी, क्योंकि समुद्री जल के स्तर के समान उच्च नमक सांद्रता कई एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को रोक सकती है। ऐसे मामलों में, मानक प्रयोगशाला बफर जैसे कि 0.2 μm फ़िल्टर किया गया, 1x PBS आमतौर पर समुद्री साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं की स्थिरता को बनाए रखने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं और डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के साथ अधिक संगत हो सकते हैं।
घनत्व ढाल शुद्धिकरण को प्रयोगात्मक लक्ष्यों और संस्कृति संरचना के आधार पर वैकल्पिक माना जा सकता है, लेकिन अधिक सख्ती से शुद्ध और पुन: प्रस्तुत करने योग्य नमूना बनाने के लिए दृढ़ता से अनुशंसित है। ईवी आबादी विषम हैं और उत्साही घनत्व की एक श्रृंखला में पाई जा सकती हैं, जो आगे तनाव, विकास की स्थिति और अन्यकारकों 4,5,6 से भिन्न होती हैं। ऊपर सूचीबद्ध घनत्व आमतौर पर साइनोबैक्टीरियल संस्कृतियों और आयोडिक्सानोल में क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं के लिए पाए जाने वाले लोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन अन्य उपभेदों में परिणाम भिन्न हो सकते हैं। अन्य घनत्व ढाल सामग्री जैसे सुक्रोज और सीएससीएल का उपयोग पुटिकाओं के लिए किया जा सकता है, लेकिन वे इन पृष्ठभूमि में विभिन्न उत्साही घनत्वों में स्थानांतरित हो जाएंगे। विभिन्न ग्रेडिएंट मीडिया पृष्ठभूमि लिपिड-संलग्न वायरस43 की वसूली को पूर्वाग्रहित कर सकती है और संभावित रूप से विभिन्न उपभेदों से पुटिकाओं की वसूली को प्रभावित कर सकती है।
पुटिकाओं को पुटिका अलगाव के माध्यम से कई बिंदुओं पर खो दिया जा सकता है, और यहां वर्णित ढाल शुद्धिकरण प्रक्रिया, पैदावार को कम करने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए दिए गए अंतिम पुटिका उपज को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा में वृद्धि। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पुटिका छर्रों के साथ काम करते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। जबकि कुछ साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं में कैरोटीनॉयड या अन्य यौगिक हो सकते हैं जो पुटिका के नमूनों को रंजकता की कुछ मात्रा में उधार दे सकते हैं (चित्रा 2), तनाव या सामग्री की मात्रा के आधार पर, यह जरूरी नहीं है कि पुटिकाओं को सीधे पैलेट की कल्पना करने में सक्षम होने की उम्मीद हो। इस बात से अवगत रहें कि गोली को उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूज रोटर के प्रकार को कहां दिए जाने की उम्मीद है। जब संभव हो, शुद्ध पुटिका के नमूनों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच करने का सुझाव दिया जाता है ताकि बरामद अंतिम सामग्री की संरचना को सत्यापित किया जा सके।
पुटिकाओं और उनकी सामग्री पर भंडारण की स्थिति का प्रभाव एक खुला सवाल बना हुआ है। हालांकि यह पाया गया है कि भंडारण साइनोबैक्टीरिया पुटिका आकार या एकाग्रता14 पर एक उल्लेखनीय प्रभाव नहीं पड़ता है, अलग-थलग पुटिका तैयारी की कार्यक्षमता समय44 के साथ बदल सकती है। जबकि फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से बचा जाना चाहिए जब भी संभव हो, समग्र पुटिका संख्याओं और आकारों पर ठंड के नमूनों का प्रभाव कम से कम प्रतीत होता है। किसी को पुटिका सामग्री की संरचना को प्रभावित करने के लिए फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों की क्षमता के बारे में पता होना चाहिए, जैसे कि पुटिका से जुड़े न्यूक्लिक एसिड की लंबाई या प्रोटीन की स्थिरता।
पुटिकाओं से field samples
प्राकृतिक जलीय वातावरण से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को अलग करने के लिए वर्तमान तरीके वैचारिक रूप से और परिचालन रूप से बड़ी मात्रा वाली संस्कृतियों के लिए यहां वर्णित लोगों के समान हैं। फिर भी, उन्हें सामग्री की अधिक मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। इस तरह के क्षेत्र के नमूनों में विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए सैकड़ों से हजारों लीटर पानी एकत्र करना, निस्पंदन और एकाग्रता शामिल हो सकती है। उपयोग किए जा रहे नमूने की टर्बिडिटी के आधार पर, 0.2 μm फ़िल्टर से पहले एक या अधिक पूर्व-निस्पंदन चरणों को शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है। उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट टीएफएफ डिवाइस को उचित मात्रा में इस तरह की बड़ी मात्रा में काम करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए (आदर्श रूप से घंटों के क्रम में) और नमूने पर अत्यधिक दबाव डाले बिना। व्यवहार में, इसमें अक्सर संस्कृति-आधारित नमूनों पर लागू होने की तुलना में बहुत अधिक कुल सतह क्षेत्र का उपयोग करना शामिल होता है, साथ ही साथ बढ़े हुए प्रवाह दरों को सुविधाजनक बनाने के लिए बड़े व्यास की टयूबिंग भी शामिल होती है। इस बढ़े हुए फ़िल्टर सतह क्षेत्र की संभावना छोटे टीएफएफ व्यवस्था और ध्यान की एक बड़ी अंतिम मात्रा की तुलना में कण हानि में मामूली वृद्धि होगी; हालांकि, इन चिंताओं को कुल प्रसंस्करण समय के विचारों के साथ संतुलित किया जाना चाहिए। एक विस्तारित महासागरीय क्रूज जैसी स्थितियों के लिए जहां नमूने कई दिनों के लिए एक प्रयोगशाला में वापस नहीं आएंगे, नमूनाकरण के बाद, हम क्षेत्र में प्रारंभिक 0.2 μm निस्पंदन और TFF चरणों को पूरा करने की सलाह देते हैं। केंद्रित सामग्री की इस छोटी मात्रा को तब बोर्ड पर 4 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (उपलब्धता और डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक विचारों के आधार पर) जब तक कि इसे अंतिम प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में वापस नहीं किया जाता है।
अन्य छोटे कणों, दोनों कार्बनिक और अकार्बनिक से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं का अलगाव और अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और विभिन्न कणों को अलग करने के तरीके अभी तक सही नहीं हैं। उदाहरण के लिए, आयोडिक्सेनॉल घनत्व ग्रेडिएंट किसी दिए गए नमूने में मौजूद पुटिकाओं और वायरस के सभी वर्गों को आसानी से अलग नहीं कर सकते हैं। जैसा कि भ्रमित कणों के प्रकार, और उनके भौतिक गुण, नमूना साइटों के बीच भिन्न होंगे, वर्तमान में एक प्रोटोकॉल प्रदान करना असंभव है जो छोटे जलीय कणों के सभी वर्गों को मजबूत रूप से विभाजित करेगा। परीक्षण और त्रुटि आवश्यक हैं, और ग्रेडिएंट और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों में उपयोग की जाने वाली आयोडिक्सानोल रेंज के साथ प्रयोग को अलगाव को अधिकतम करने के लिए आवश्यक होगा; छोटी मात्रा का एक संग्रह, अधिक बारीक रूप से हल घनत्व अंशों की भी आवश्यकता हो सकती है। संदर्भ के आधार पर, आयोडिक्सेनॉल के बजाय सीएससीएल ग्रेडिएंट का उपयोग करने से पर्यावरणीय कणोंको अलग करने में मदद मिल सकती है। फिर भी, आसमाटिक स्थितियों में परिवर्तन अंतिम बरामद उत्पादों में पूर्वाग्रहों को जन्म दे सकता है, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है।
पुटिका लक्षण वर्णन
नैनोपार्टिकल विश्लेषण उपकरण अभी तक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला सेटिंग्स में नियमित रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन तेजी से उपलब्ध हो रहे हैं। सभी तरीकों में पेशेवरों और विपक्ष हैं, और हम साइनोबैक्टीरिया पुटिका के काम के लिए अन्य सभी की तुलना में बेहतर होने के रूप में एक मंच का कोई विशिष्ट समर्थन नहीं करते हैं; वास्तव में, सभी के पास लागत, संकल्प, उपयोग में आसानी, पता लगाने की सीमा, विभिन्न विकास मीडिया / बफर पृष्ठभूमि के साथ संगतता, और डेटा पुनरुत्पादन से संबंधित विशेष व्यापार-बंद हैं। ऊपर वर्णित नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण पर आधारित उपकरणों के अलावा, नैनोफ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोफ्लुइडिक प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग, और ट्यूनेबल प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग सहित अन्य दृष्टिकोणों को46,47 लागू किया जा सकता है। उपयोगकर्ताओं को अपने उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन के विवरण को जानने और यह सत्यापित करने के लिए सावधान रहना चाहिए कि यह उनके सिस्टम के साथ अच्छी तरह से काम करता है, क्योंकि समुद्री जल-आधारित मीडिया के साथ कुछ प्लेटफार्मों का उपयोग करते समय हमें कठिनाइयों का सामना करना पड़ा है। हम क्षेत्र को पुटिका आकार, सांद्रता और उत्पादन दरों के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की ओर बढ़ने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। प्रति एमएल आधार पर एक मौलिक कण पर पुटिका सांद्रता को मापने, और प्रोटीन सामग्री या अन्य मीट्रिक के संदर्भ में नहीं, अधिक मात्रात्मक ढांचे में पुटिकाओं के एकीकरण के लिए अनुमति देगा और उपभेदों और स्थितियों के बीच अंतर-तुलना को सक्षम करेगा। <100nm कणों के लिए एकाग्रता माप को कैलिब्रेट करने की क्षमता में सुधार करने के लिए आगे के प्रयासों की आवश्यकता है।
तथ्य यह है कि पुटिका उत्पादन दर माप सीधे 0.2 μm फ़िल्टर्ड संस्कृति supernatant से कण नुकसान को कम करने के लिए किया जाता है ऊपर वर्णित अन्य शुद्धिकरण चरणों के साथ जुड़ा होगा। हालांकि, इसका मतलब यह है कि दृष्टिकोण आवश्यक रूप से वास्तविक बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं और संस्कृतियों में पाए जाने वाले अन्य छोटे कणों के बीच भेदभाव नहीं करता है। केवल विशिष्ट आकार सीमाओं (जैसे, 50-250 एनएम व्यास) के भीतर कणों की गिनती कुछ बाहरी लोगों को बाहर करने में मदद कर सकती है, लेकिन दृश्य पुष्टि है कि पैलेट <0.2 μm संस्कृति सामग्री झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं (टीईएम या अन्य दृष्टिकोणों द्वारा) प्रतीत होती है, विशेष रूप से यह दावा करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है कि कोई पुटिका जैसे कणों के उत्पादन के विपरीत पुटिकाओं के उत्पादन को माप रहा है।
पुटिका लक्षण वर्णन में एक आवश्यक कारक यह सुनिश्चित करना है कि पुटिका के नमूने का विश्लेषण नैनोपार्टिकल विश्लेषण डिवाइस की उचित रैखिक संवेदनशीलता सीमा में किया जा रहा है। जब एक नमूना बहुत केंद्रित होता है, तो उस सामग्री को एक साफ बफर के साथ पतला करना और इसका फिर से विश्लेषण करना सीधा होता है। दूसरी ओर, कुछ साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों के अपेक्षाकृत कम सेल और / या पुटिका घनत्व कभी-कभी पुटिका तैयारी पैदा कर सकते हैं जो कुछ उपकरणों की पहचान सीमा से नीचे हैं। ऐसे मामलों में जहां यह थोक पुटिका शुद्धिकरण के साथ होता है, कोई भी बड़ी मात्रा वाली संस्कृतियों को बढ़ाने, एक छोटी मात्रा में अंतिम सामग्री को फिर से गोली मारने और फिर से निलंबित करने पर विचार कर सकता है, या मूल्यांकन कर सकता है कि क्या अलगाव प्रक्रिया में कोई कदम है जहां अत्यधिक नुकसान हो रहा है और इसे कम किया जा सकता है। पुटिका उत्पादन दरों को मापते समय, फिक्स जरूरी नहीं कि इतने सरल हों। यदि आवश्यक हो तो नमूनों को केंद्रित किया जा सकता है, लेकिन पहले व्यक्ति को यह देखना चाहिए कि क्या मीडिया में समायोजन के परिणामस्वरूप उच्च सेल घनत्व हो सकता है या क्या घातीय चरण के दौरान बाद के समय बिंदुओं से पर्याप्त रूप से केंद्रित नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं जहां सांद्रता अधिक होगी।
सीमाओं
किसी भी प्रोटोकॉल के साथ, इन दृष्टिकोणों का उपयोग करके पुटिका अलगाव की स्पष्ट सीमाएं हैं। ये दृष्टिकोण उनकी गारंटी पर भरोसा नहीं करते हैं कि पुटिकाओं की पूरी तरह से शुद्ध तैयारी को अलग कर दिया जाएगा। दोनों संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों में अन्य सामग्री हो सकती है, जो घनत्व ग्रेडिएंट में पुटिकाओं के समान प्रवास करती हैं। फिर भी, कम से कम, इन प्रकार के अतिरिक्त शुद्धिकरण के तरीके पुटिका विश्लेषण की कठोरता और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। जबकि हम साइनोबैक्टीरिया के संदर्भ में पुटिका अलगाव दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, कई अन्य रोगाणुओं की संस्कृतियों में तुलनात्मक रूप से कम सांद्रता में पुटिकाएं भी होंगी, और यहां वर्णित प्रक्रियाएं आम तौर पर लागू होनी चाहिए। यह उम्मीद की जाती है कि ये तरीके एक स्थायी प्रोटोकॉल के रूप में नहीं बल्कि इसके बजाय विभिन्न रोगाणुओं से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के साथ काम करने में भविष्य की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करेंगे। संस्कृतियों और पर्यावरणीय नमूनों से छोटे कणों की विभिन्न श्रेणियों के भेदभाव और अलगाव में सुधार करने के लिए आकार बहिष्करण कॉलम या असममित क्षेत्र प्रवाह फ्रैक्शनेशन जैसे अन्य दृष्टिकोणों के साथ इन विधियों को विलय करने के लिए भविष्य के प्रयासों की आवश्यकता होती है। हमें यह भी उम्मीद है कि ये तकनीकें पुटिका आबादी, उनकी सामग्री और पर्यावरण में उनकी सटीक कार्यात्मक भूमिकाओं के भीतर विषमता की जांच करने की क्षमता में सुधार करने के लिए नैनोपार्टिकल लक्षण वर्णन प्रौद्योगिकियों में सुधार के साथ विकसित करना जारी रख सकती हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखकi3S वैज्ञानिक प्लेटफार्मों “Biointerfaces और नैनो टेक्नोलॉजी”, और “Histology and Electron Microscopy”, Bioimaging के राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) के एक सदस्य के समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम टीईएम के लिए अल्ट्रा-थिन सेक्शन स्टेनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए प्रोफेसर जे ए गोंजालेज-रेयेस (कॉर्डोबा विश्वविद्यालय, स्पेन) और डॉ सेसिलिया ड्यूरेस और डॉ एना रीटा पिंटो (पोर्टो विश्वविद्यालय, पुर्तगाल) को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए धन्यवाद देते हैं।
इस काम को यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (OCE-2049004 से SJB तक) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, Fundo Europeu de De De Dessenvolvimento Regional (FEDER) द्वारा Compete 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalization (POCI), पुर्तगाल, 2020 के माध्यम से, और Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-05 के ढांचे में Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-01 के ढांचे में 01-05-010000 के ढांचे में। Fundação पैरा एक Ciência e एक Tecnologia भी पीएचडी फैलोशिप SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) के लिए बहुत स्वीकार किया जाता है, और FCT अन्वेषक अनुदान IF / 00256 / 2015 (पीओ)। M.C.M.-M. क्षितिज 2020 फ्रेमवर्क प्रोग्राम (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) के भीतर एक मैरी Skloodowska-Curie व्यक्तिगत फैलोशिप (Reintegration पैनल) द्वारा समर्थित था।
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Home-made buffer | — | Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially |
2% Uranyl acetate solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | Negative staining – TEM |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining |
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) | Merck | UFC9100XX | Alternative option for centrifugal ultrafiltration |
BG11 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803 |
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu | Electron Microscopy Sciences | 71150 | Transmission electron microscopy (TEM) grid |
easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000 | Commercial TEM grid glow discharger |
EMbed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Ultra-thin sections – TEM |
Filter holder for vacuum system | Thermo Fisher Scientific | 300-4000 | Reusable units with filter membrane support plates |
Glutaraldehyde Grade I | Sigma-Aldrich | G5882-10X1ml | Ultra-thin sections – TEM |
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] | Sigma-Aldrich | H7006 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Lead Citrate, Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | Stain for use in electron microscopy |
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K | Pall | MAP100C36 | For centrifugal ultrafiltration of small volume samples |
Millipore Pellicon 3 TFF Module | EMD Millipore | XX42P0060 or XX42P0080 | Alternative TFF option for concentrating large volume samples |
Milli-Q Reference Water Purification System | Merck | Z00QSV0WW | Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water |
NanoSight | Malvern Panalytical | LM14 or NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
Optima L80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L80 XP | Ultracentrifuge (or similar model) |
OptiPrep / Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Density gradient media |
Osmium Tetroxide Reagent Plus | Sigma-Aldrich | 201030 | Ultra-thin sections – TEM |
Pall Centramate PE TFF holder | Pall Corporation | FS002K10 | TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes |
Peristaltic pump Masterflex L/S | Cole-Parmer | 07559-07 | Pump for driving large-scale TFF modules |
Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments | 152-001 | Automated density gradient fractionation |
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 355618 | Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly |
Pro99 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Prochlorococcus |
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | P20495 | LPS staining |
SN medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250-100G | Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM |
SW32Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
SW60Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 335650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes |
Syringe 1mL Luer | BD Plastipak | 303172 | For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment |
Syringe filter 0.2 µm | Pall Corporation | 4602 | For vesicle isolation from cultures |
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | T5130 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Or similar microscope |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
Type XIV protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining |
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 344058 | Single use ultracentrifuge tubes |
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 344062 | Single use ultracentrifuge tubes |
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC | RMC Products, Boeckeler Instruments | 75501 | Microtome for ultra-thin sections – TEM |
Universal 320 R centrifuge | Hettich | Z654736 | This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells |
Vacuum apparatus | KNF Neuberger | N026.3 AT.18 | Or any similar vacuum pump and trap |
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES | Sartorius | VF20P4 | TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1). |
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) | Cytiva | 6717-9502 | Capsule filter for filtering large volumes of liquid |
Zetasizer | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | Dynamic light scattering (DLS) instrument |