Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche
Summary
Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l’isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.
Abstract
I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di batteri fotosintetici e Gram-negativi che svolgono ruoli critici negli ecosistemi globali e fungono da modelli biotecnologici essenziali. Lavori recenti hanno dimostrato che sia i cianobatteri marini che quelli d’acqua dolce producono vescicole extracellulari – piccole strutture legate alla membrana rilasciate dalla superficie esterna dei microbi. Mentre le vescicole probabilmente contribuiscono a diversi processi biologici, i loro ruoli funzionali specifici nella biologia cianobatterica rimangono in gran parte sconosciuti. Per incoraggiare e far progredire la ricerca in questo settore, viene presentato un protocollo dettagliato per isolare, concentrare e purificare le vescicole extracellulari cianobatteriche. Il lavoro attuale discute le metodologie che hanno isolato con successo le vescicole da grandi colture di Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. Vengono presentati i metodi per quantificare e caratterizzare i campioni di vescicole di questi ceppi. Vengono inoltre descritti approcci per isolare le vescicole dai campioni di campo acquatico. Infine, vengono discusse anche le sfide tipiche incontrate con la purificazione delle vescicole cianobatteriche, le considerazioni metodologiche per le diverse applicazioni a valle e i compromessi tra gli approcci.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture sferiche, che variano tra ~ 20-400 nm di diametro, rilasciate praticamente da tutti gli organismi nel loro ambiente circostante 1,2,3. Le vescicole sono delimitate da un doppio strato lipidico e non possono replicarsi. Nei batteri Gram-negativi, si pensa che queste strutture sorgano principalmente per “blebbing” di piccole porzioni dalla membrana esterna. Tuttavia, altri processi, tra cui il movimento flagellare, la lisi cellulare e la secrezione di materiale di membrana sia interno che esterno, possono produrre vescicole anche 4,5. Gli EV possono contenere varie biomolecole, tra cui lipidi, proteine solubili e di membrana, acidi nucleici e metaboliti, e possono trasportare questo materiale tra le cellule 4,5,6. Date queste caratteristiche, i veicoli elettrici sono in fase di studio per comprendere i loro possibili ruoli in una vasta gamma di processi biologici, tra cui la comunicazione cellulare, la formazione di biofilm, il trasferimento genico orizzontale, la dinamica ospite-fago e lo scambio di nutrienti 4,6.
I cianobatteri sono un gruppo ampio e diversificato di batteri Gram-negativi, compresi organismi unicellulari e filamentosi. Sono di interesse da molte prospettive, tra cui la comprensione della loro fisiologia e diversità 7,8, le funzioni critiche dell’ecosistema che servono 9,10 e la loro utilità per la biotecnologia11,12. I cianobatteri si trovano in un’ampia varietà di habitat, sia come organismi viventi liberi in ambienti marini, d’acqua dolce e terrestri, sia in associazioni simbiotiche con muschi, felci, piante o in licheni e spugne13. Servono come produttori primari cruciali negli ecosistemi acquatici, producendo ossigeno e carbonio organico attraverso la fotosintesi ossigenata 9,10, e alcuni sono in grado di fissare anche l’azoto atmosferico7. I cianobatteri marini e d’acqua dolce, tra cui Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, producono veicoli elettrici in condizioni di laboratorio 14,15,16 e le vescicole cianobatteriche si possono trovare anche in ambienti naturali14,17. Le funzioni biologiche ed ecologiche delle vescicole cianobatteriche sono sconosciute, ma è probabile che ulteriori ricerche in questo settore forniscano nuove intuizioni su questioni relative alla fisiologia cianobatterica, alla differenziazione, alle strategie di comunicazione, all’evoluzione e alle interazioni trofiche. Inoltre, la capacità dei veicoli elettrici cianobatterici di trasportare diverse categorie di biomolecole può avere applicazioni commerciali18,19.
Il presente protocollo descrive i metodi per isolare e caratterizzare le vescicole da colture cianobatteriche e campioni di campo per consentire e incoraggiare un esame più ampio della biologia delle vescicole extracellulari cianobatteriche. Mentre il flusso di lavoro qui descritto è analogo ai protocolli per isolare e caratterizzare i veicoli elettrici da altri batteri, le colture cianobatteriche e i campioni di campo contengono in genere concentrazioni di cellule e vescicole inferiori a quelle comunemente osservate con i sistemi modello associati all’ospite o patogeni 20,21,22. Pertanto, gli studi sui veicoli elettrici cianobatterici richiedono considerazioni e ottimizzazioni speciali per la coltivazione e l’isolamento delle vescicole, che variano ulteriormente tra ceppi e background dei mezzi. Poiché nessun singolo protocollo funzionerà ugualmente bene per tutti i ceppi, le condizioni di crescita e le applicazioni a valle, forniamo più opzioni e discutiamo i compromessi coinvolti in modo che i ricercatori possano determinare gli approcci più appropriati per affrontare le loro domande sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerazioni generali
Il protocollo (Figura 1) è presentato come un insieme di opzioni per evidenziare che non esiste un metodo “taglia unica” per lavorare con vescicole extracellulari cianobatteriche. I ricercatori interessati possono utilizzare le sezioni di questo protocollo che sono compatibili e appropriate per il loro particolare organismo modello, domande / obiettivi sperimentali e disponibilità di attrezzature. Tutti gli approcci di isolamento delle vescicole comportano compromessi e si tradurranno inevitabilmente in un certo grado di pregiudizio. Mentre si dovrebbe cercare di minimizzare questo quando possibile, la considerazione più cruciale è quella di garantire che la metodologia dettagliata utilizzata sia riportata secondo le linee guida MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.
Crescita della cultura
Le colture cianobatteriche possono essere facilmente ottenute da una delle tante collezioni di colture disponibili in tutto il mondo. Alcuni esempi sono la Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Francia), la Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Parigi, Francia) e il Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Il ceppo cianobatterico scelto deve essere coltivato nelle condizioni medie e ambientali appropriate, variando in modo significativo tra i diversi ceppi. Un elenco di mezzi comunemente usati per la coltivazione cianobatterica può essere trovato su siti web di raccolta di colture o altre pubblicazioni 37,38,39.
Lavorare con vescicole extracellulari cianobatteriche presenta alcune sfide uniche rispetto alle metodologie riportate per molti tipici modelli di eterotrofi di laboratorio. Le colture cianobatteriche hanno concentrazioni di vescicole di ordini di grandezza inferiori a quelle che si trovano in altri microbi come Escherichia coli 14,16,40. Queste differenze, presumibilmente derivanti da densità cellulari più basse e/o tassi di produzione di vescicole, significano che possono essere necessarie colture relativamente grandi (~ 1-20 L o più) per produrre materiale sufficiente per analisi di massa. Pertanto, i ricercatori sono incoraggiati a testare le rese di vescicole da colture su scala più piccola per determinare quanto materiale sarà necessario per raggiungere gli obiettivi finali desiderati. Anche l’importanza di stabilire se il mezzo utilizzato per l’esperimento ha un fondo di particolato rilevabile deve essere sottolineata prima di iniziare qualsiasi esperimento, poiché tale materiale può potenzialmente confondere la quantificazione della popolazione delle vescicole, ridurre la sensibilità delle misurazioni della concentrazione / dimensione delle vescicole o contaminare i preparati finali delle vescicole.
Un’altra sfida per il campo è che non tutti i cianobatteri crescono bene, o affatto, in pura cultura. Fino a quando non saranno rese aspre, le interpretazioni delle caratteristiche fisiche delle vescicole, dei tassi di produzione o del contenuto non possono necessariamente portare a conclusioni chiare sulle vescicole prodotte da qualsiasi ceppo nella comunità. Si consiglia inoltre ai ricercatori di considerare quali altri tipi di particelle potrebbero essere presenti e potenzialmente confusi con le vescicole da specifici strumenti di analisi delle nanoparticelle, che non possono necessariamente discriminare tra diversi tipi di particelle. Ad esempio, può essere essenziale verificare che il ceppo utilizzato manchi di un profago, tramite sequenziamento del genoma, saggi di induzione o altri mezzi o non rilasci altri tipi di particolato. Nella nostra esperienza, la maggior parte delle vescicole cianobatteriche hanno un diametro di < 0,2 μm, ma quando si osserva un nuovo ceppo o condizione di crescita, si dovrebbe confermare se l'uso di un filtro di dimensioni dei pori di 0,45 μm altera la distribuzione dimensionale delle particelle purificate.
Molti aspetti delle condizioni di coltura possono influenzare la produzione di vescicole e il suo contenuto41,42. Pertanto, le condizioni fisiche e chimiche utilizzate per la crescita della coltura (compresa l’irradianza luminosa, la temperatura e la composizione dei mezzi) devono essere documentate e controllate nella misura possibile per garantire la riproducibilità dei risultati. Qualsiasi analisi chimica del contenuto delle vescicole deve tenere conto della composizione di fondo, in particolare quando si eseguono analisi ad alta produttività in stile “omico”. Questo può essere particolarmente critico quando si utilizzano mezzi indefiniti, come quelli basati su uno sfondo naturale di acqua di mare o integrati con estratto di lievito o triptone. L’uso di un mezzo di crescita definito può essere preferibile a seconda degli obiettivi sperimentali.
I ricercatori devono monitorare attentamente le dinamiche di crescita della coltura a intervalli regolari per assicurarsi di sapere dove si trova una determinata coltura batch e non solo raccogliere campioni dopo un periodo di tempo arbitrario. La composizione delle vescicole può variare tra le fasi di crescita, in particolare tra le fasi esponenziali e stazionarie41,42. Ad esempio, almeno una frazione di vescicole campionate nella fase stazionaria può derivare da un diverso meccanismo cellulare, come la lisi cellulare, che non si verificherà durante la crescita esponenziale. Anche se questo può ancora essere di grande interesse biologico, è essenziale conoscere il campione. Se una coltura cianobatterica raggiunge la fase di crescita desiderata in un momento in cui non è possibile procedere direttamente alla concentrazione del campione, si consiglia di separare immediatamente le cellule dalla frazione < 0,2 μm (con centrifugazione e/o filtrazione diretta da 0,2 μm) e quindi conservare il filtrato cell-free a 4 °C. Il materiale può essere conservato in questo modo per giorni con un impatto minimo o nullo sulla concentrazione o sulla distribuzione dimensionale delle vescicole.
Purificazioni di vescicole
La frequente necessità di isolare le vescicole da colture di volume significativo è vitale nel flusso di lavoro di isolamento delle vescicole cianobatteriche. Quando si lavora con volumi maggiori di materiale, le vescicole dovranno essere concentrate prima dei flussi di lavoro di separazione a valle. I concentratori (membrane filtranti a flusso tangenziale o colonne centrifughe) con un limite di peso molecolare nominale di 100 kDa sono generalmente consigliati, in quanto consentono la separazione da materiale solubile a basso peso molecolare mantenendo ragionevoli i tempi di concentrazione, ma anche i filtri da 30 kDa sono spesso utilizzati con successo. Mentre diversi metodi non ultracentrifugati per purificare le vescicole (ad esempio, cromatografia di esclusione dimensionale, sistemi basati su microfluidica, tecniche di cattura dell’affinità e approcci basati sulla precipitazione) stanno diventando popolari nel campo delle vescicole extracellulari, nella nostra esperienza, questi approcci possono comportare una diminuzione delle rese e sono in genere incompatibili con i volumi di coltura necessari.
I ricercatori devono considerare la composizione dello sfondo di iodixanolo e i tamponi di lavaggio / risospensione utilizzati durante la purificazione delle vescicole per garantire che siano compatibili con le applicazioni a valle desiderate. In molti casi, il campione finale di vescicola può essere risospeso in mezzi di crescita o in un tampone definito paragonabile per composizione al mezzo di crescita (ad esempio, acqua di mare naturale o artificiale). Tuttavia, questo potrebbe non essere possibile con le vescicole cianobatteriche marine, che richiederanno ulteriori manipolazioni sperimentali per l’analisi, poiché alte concentrazioni di sale simili ai livelli di acqua di mare possono inibire molte reazioni enzimatiche. In questi casi, i tamponi di laboratorio standard come 0,2 μm filtrati, 1x PBS in genere funzionano bene per mantenere la stabilità delle vescicole cianobatteriche marine e possono essere più compatibili con i processi sperimentali a valle.
La purificazione del gradiente di densità può essere considerata facoltativa a seconda degli obiettivi sperimentali e della composizione della coltura, ma è fortemente raccomandata per produrre un campione più rigorosamente puro e riproducibile. Le popolazioni ev sono eterogenee e possono essere trovate in una gamma di densità galleggianti, che variano ulteriormente in base alla deformazione, alle condizioni di crescita e ad altri fattori 4,5,6. Le densità sopra elencate rappresentano quelle tipicamente trovate per le vescicole provenienti da colture cianobatteriche e campioni di campo in iodixanolo, ma i risultati in altri ceppi possono variare. Altri materiali con gradiente di densità come il saccarosio e il CsCl possono essere utilizzati per le vescicole, ma migreranno a diverse densità di galleggiamento in questi sfondi. Diversi background di gradienti possono influenzare il recupero dei virus lipidici43 e potrebbero potenzialmente influenzare il recupero delle vescicole da diversi ceppi.
Le vescicole possono essere perse in più punti attraverso l’isolamento delle vescicole e il processo di purificazione del gradiente qui descritto, riducendo le rese e aumentando la quantità di materiale di partenza necessaria per ottenere una determinata resa finale delle vescicole per le applicazioni a valle. Particolare attenzione deve essere prestata quando si lavora con pellet di vescicole dopo l’ultracentrifugazione. Mentre alcune vescicole cianobatteriche possono avere carotenoidi o altri composti che possono prestare a campioni di vescicole una certa quantità di pigmentazione (Figura 2), a seconda della deformazione o della quantità di materiale, non ci si aspetta necessariamente che sia in grado di visualizzare direttamente il pellet di vescicole. Essere consapevoli di dove ci si aspetta che il pellet venga dato il tipo di rotore della centrifuga utilizzato. Quando possibile, si suggerisce di esaminare al microscopio elettronico campioni di vescicole purificate per verificare la composizione del materiale finale recuperato.
L’impatto delle condizioni di conservazione sulle vescicole e sul loro contenuto rimane una questione aperta. Sebbene si sia riscontrato che la conservazione non ha un effetto notevole sulla dimensione delle vescicole cianobatteriche o sulla concentrazione14, la funzionalità dei preparati di vescicole isolate può cambiare nel tempo44. Mentre i cicli di congelamento/ disgelo dovrebbero essere evitati quando possibile, l’impatto del congelamento dei campioni sul numero e sulle dimensioni complessive delle vescicole sembra essere minimo. Si dovrebbe essere consapevoli del potenziale dei cicli di congelamento-disgelo per influenzare la composizione del contenuto di vescicole, come la lunghezza degli acidi nucleici associati alle vescicole o la stabilità delle proteine.
Vescicole da field samples
Gli attuali metodi per isolare le vescicole extracellulari dagli ambienti acquatici naturali sono concettualmente e operativamente simili a quelli descritti qui per le colture di grandi volumi. Tuttavia, possono richiedere volumi di materiale ancora maggiori. Tali campioni sul campo possono comportare la raccolta, la filtrazione e la concentrazione di centinaia o migliaia di litri di acqua per ottenere materiale sufficiente per l’analisi. A seconda della torbidità del campione utilizzato, potrebbe essere necessaria l’incorporazione di una o più fasi di prefiltrazione prima del filtro da 0,2 μm. Il dispositivo TFF specifico utilizzato dovrebbe essere appropriato per lavorare con volumi così grandi in un ragionevole lasso di tempo (idealmente nell’ordine delle ore) e senza esercitare una pressione eccessiva sul campione. In pratica, ciò comporta spesso l’utilizzo di una superficie totale molto maggiore di quella che potrebbe essere applicata ai campioni basati sulla coltura, nonché tubi di diametro maggiore per facilitare l’aumento delle portate. Questa maggiore superficie del filtro porterà probabilmente ad un aumento marginale delle perdite di particelle rispetto alle disposizioni TFF più piccole e a un volume finale maggiore di concentrato; tuttavia, queste preoccupazioni devono essere bilanciate con considerazioni sul tempo totale di elaborazione. Per situazioni come una crociera oceanografica prolungata in cui i campioni non torneranno in laboratorio per molti giorni dopo il campionamento, si consiglia di eseguire la filtrazione iniziale di 0,2 μm e le fasi TFF sul campo. Questo volume minore di materiale concentrato può quindi essere immagazzinato a 4 °C o -80 °C a bordo (a seconda della disponibilità e delle considerazioni analitiche a valle) fino a quando non viene restituito al laboratorio per la lavorazione finale.
L’isolamento e la separazione delle vescicole extracellulari da altre piccole particelle, sia organiche che inorganiche, possono essere impegnative e i metodi per separare le diverse particelle non sono ancora perfetti. Ad esempio, i gradienti di densità dello iodixanolo potrebbero non separare facilmente tutte le classi di vescicole e virus presenti in un dato campione. Poiché i tipi di particelle confondenti e le loro proprietà fisiche variano tra i siti di campionamento, è attualmente impossibile fornire un protocollo che partiziona in modo robusto tutte le classi di piccole particelle acquatiche. Tentativi ed errori sono essenziali e sarà necessaria la sperimentazione con la gamma di iodixanolo utilizzata nelle condizioni di gradiente e ultracentrifugazione per massimizzare la separazione; può anche essere necessaria una raccolta di frazioni di densità più piccole e più finemente risolte. A seconda del contesto, l’uso di gradienti CsCl invece di iodixanolo può aiutare a separare le particelle ambientali45. Tuttavia, il cambiamento delle condizioni osmotiche potrebbe portare a distorsioni nei prodotti finali recuperati, come discusso sopra.
Caratterizzazione delle vescicole
Gli strumenti di analisi delle nanoparticelle non sono ancora regolarmente disponibili nei laboratori di microbiologia, ma stanno diventando sempre più disponibili. Tutte le metodologie hanno pro e contro, e non facciamo alcuna approvazione specifica di una piattaforma come migliore di tutte le altre per il lavoro delle vescicole cianobatteriche; in effetti, tutti hanno particolari compromessi riguardanti costi, risoluzione, facilità d’uso, limiti di rilevamento, compatibilità con diversi media di crescita / sfondi buffer e riproducibilità dei dati. Oltre agli strumenti basati sull’analisi di tracciamento delle nanoparticelle sopra descritta, altri approcci, tra cui la citometria a nanoflusso, il rilevamento di impulsi resistivi microfluidici e il rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili, possono essere applicati46,47. Gli utenti dovrebbero fare attenzione a conoscere i dettagli della loro strumentazione disponibile e verificare che funzioni bene con il loro sistema, poiché abbiamo riscontrato difficoltà quando si utilizzano alcune piattaforme con supporti a base di acqua di mare. Incoraggiamo il campo a muoversi verso la caratterizzazione quantitativa delle dimensioni delle vescicole, delle concentrazioni e dei tassi di produzione. Misurare le concentrazioni di vescicole su una particella fondamentale per mL, e non in termini di contenuto proteico o altre metriche, consentirà l’integrazione delle vescicole in quadri più quantitativi e consentirà l’intercomparazione tra ceppi e condizioni. Sono necessari ulteriori sforzi per migliorare la capacità di calibrare le misurazioni della concentrazione per particelle <100nm.
Il fatto che le misurazioni della velocità di produzione delle vescicole vengano eseguite direttamente dal surnatante di coltura filtrato da 0,2 μm per ridurre al minimo le perdite di particelle sarebbe associato ad altre fasi di purificazione sopra descritte. Tuttavia, ciò significa che l’approccio non discrimina necessariamente tra vescicole extracellulari reali e altre piccole particelle presenti nelle colture. Solo il conteggio delle particelle all’interno di intervalli di dimensioni specifici (ad esempio, diametro 50-250 nm) può aiutare a escludere alcuni valori anomali, ma la conferma visiva che i contenuti di coltura di < 0,2 μm pellettati sembrano essere vescicole legate alla membrana (tramite TEM o altri approcci) è necessaria per poter affermare specificamente che si sta misurando la produzione di vescicole rispetto alla produzione di particelle simili a vescicole.
Un fattore essenziale nella caratterizzazione delle vescicole è garantire che il campione di vescicole venga analizzato nell’intervallo di sensibilità lineare appropriato del dispositivo di analisi delle nanoparticelle. Quando un campione è troppo concentrato, è semplice diluire quel materiale con un buffer pulito e rianalizzarlo. D’altra parte, la densità relativamente bassa di cellule e / o vescicole di alcune colture cianobatteriche può talvolta produrre preparati di vescicole che sono al di sotto dei limiti di rilevamento di alcuni strumenti. Nei casi in cui ciò si verifica con la purificazione delle vescicole sfuse, si può prendere in considerazione la crescita di colture di volume maggiore, la ricombinatura e la risospendizione del materiale finale in un volume più piccolo, o la valutazione se esiste una fase del processo di isolamento in cui si verificano perdite eccessive e potrebbero essere mitigate. Quando si misurano i tassi di produzione di vescicole, le correzioni non sono necessariamente così semplici. I campioni possono essere concentrati se necessario, ma il primo dovrebbe vedere se gli aggiustamenti al mezzo potrebbero comportare densità cellulari più elevate o se campioni sufficientemente concentrati potrebbero essere ottenuti da punti temporali successivi durante la fase esponenziale in cui le concentrazioni saranno più elevate.
Limitazioni
Come con qualsiasi protocollo, l’isolamento delle vescicole utilizzando questi approcci ha chiari limiti. Questi approcci non si basano sulla loro garanzia che una preparazione completamente pura di vescicole sarà isolata. Sia le colture che i campioni di campo possono contenere altri materiali, che migrano in modo simile alle vescicole nei gradienti di densità. Tuttavia, come minimo, questi tipi di metodologie di purificazione aggiuntive sono essenziali per garantire rigore e riproducibilità dell’analisi delle vescicole. Mentre descriviamo gli approcci di isolamento delle vescicole nel contesto dei cianobatteri, le colture di molti altri microbi conterranno anche vescicole a concentrazioni relativamente basse e le procedure qui descritte dovrebbero essere generalmente applicabili. Si prevede che questi metodi serviranno non come protocollo permanente, ma piuttosto come punto di partenza per stimolare futuri progressi nel lavoro con vescicole extracellulari di diversi microbi. Sono necessari sforzi futuri per fondere questi metodi con altri approcci come le colonne di esclusione delle dimensioni o il frazionamento asimmetrico del flusso di campo per migliorare la discriminazione e la separazione di diverse categorie di piccole particelle da colture e campioni ambientali. Siamo anche fiduciosi che queste tecniche possano continuare ad evolversi insieme ai miglioramenti nelle tecnologie di caratterizzazione delle nanoparticelle per migliorare la capacità di esaminare l’eterogeneità all’interno delle popolazioni di vescicole, il loro contenuto e i loro esatti ruoli funzionali nell’ambiente.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno delle piattaforme scientifiche i3S “Biointerfacce e nanotecnologie” e “Istologia e microscopia elettronica”, membro dell’infrastruttura nazionale Piattaforma portoghese di bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Ringraziamo anche il Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Università di Córdoba, Spagna) per aver contribuito a ottimizzare il protocollo di colorazione della sezione ultrasottile per TEM, e la Dott.ssa Cecília Durães e la Dott.ssa Ana Rita Pinto (Università di Porto, Portogallo) per l’analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
Questo lavoro è stato finanziato dalla US National Science Foundation (OCE-2049004 to SJB), dal Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portogallo, 2020, e da fondi portoghesi attraverso Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior nell’ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia è anche fortemente riconosciuta per la borsa di dottorato SFRH / BD / 130478/2017 (SL) e la sovvenzione FCT Investigator IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. è stato sostenuto da una borsa di studio individuale Marie Skłodowska-Curie (gruppo di esperti sul reinserimento) nell’ambito del programma quadro Orizzonte 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).
Materials
| 1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Home-made buffer | — | Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially |
| 2% Uranyl acetate solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | Negative staining – TEM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) | Merck | UFC9100XX | Alternative option for centrifugal ultrafiltration |
| BG11 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803 |
| Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu | Electron Microscopy Sciences | 71150 | Transmission electron microscopy (TEM) grid |
| easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000 | Commercial TEM grid glow discharger |
| EMbed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Ultra-thin sections – TEM |
| Filter holder for vacuum system | Thermo Fisher Scientific | 300-4000 | Reusable units with filter membrane support plates |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma-Aldrich | G5882-10X1ml | Ultra-thin sections – TEM |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] | Sigma-Aldrich | H7006 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
| Lead Citrate, Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | Stain for use in electron microscopy |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K | Pall | MAP100C36 | For centrifugal ultrafiltration of small volume samples |
| Millipore Pellicon 3 TFF Module | EMD Millipore | XX42P0060 or XX42P0080 | Alternative TFF option for concentrating large volume samples |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck | Z00QSV0WW | Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water |
| NanoSight | Malvern Panalytical | LM14 or NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| Optima L80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L80 XP | Ultracentrifuge (or similar model) |
| OptiPrep / Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Density gradient media |
| Osmium Tetroxide Reagent Plus | Sigma-Aldrich | 201030 | Ultra-thin sections – TEM |
| Pall Centramate PE TFF holder | Pall Corporation | FS002K10 | TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes |
| Peristaltic pump Masterflex L/S | Cole-Parmer | 07559-07 | Pump for driving large-scale TFF modules |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments | 152-001 | Automated density gradient fractionation |
| Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 355618 | Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly |
| Pro99 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Prochlorococcus |
| Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | P20495 | LPS staining |
| SN medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250-100G | Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM |
| SW32Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
| SW60Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 335650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes |
| Syringe 1mL Luer | BD Plastipak | 303172 | For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment |
| Syringe filter 0.2 µm | Pall Corporation | 4602 | For vesicle isolation from cultures |
| TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | T5130 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Or similar microscope |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
| Type XIV protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining |
| UltraClear tubes for the SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 344058 | Single use ultracentrifuge tubes |
| UltraClear tubes for the SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 344062 | Single use ultracentrifuge tubes |
| Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC | RMC Products, Boeckeler Instruments | 75501 | Microtome for ultra-thin sections – TEM |
| Universal 320 R centrifuge | Hettich | Z654736 | This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells |
| Vacuum apparatus | KNF Neuberger | N026.3 AT.18 | Or any similar vacuum pump and trap |
| Vivaflow 200 100,000 MWCO PES | Sartorius | VF20P4 | TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1). |
| Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) | Cytiva | 6717-9502 | Capsule filter for filtering large volumes of liquid |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | Dynamic light scattering (DLS) instrument |
Referencias
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
- Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
- Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
- Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
- Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What’s in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
- Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
- Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
- Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
- Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
- Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
- Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
- Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
- Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
- Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
- Partensky, F., Blanchot, J., Vaulot, D., Charpy, L., Larkum, A. W. D. . Bulletin de l’Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
- Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
- Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
- McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
- Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
- Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
- Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , 3-27 (1988).
- Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
- Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
- Dell’Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
- Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
- Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
- Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).
