Den nuværende protokol indeholder detaljerede beskrivelser af isolering, koncentration og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra cyanobakterielle kulturer. Tilgange til rensning af vesikler fra kulturer i forskellige skalaer, afvejninger mellem metoder og overvejelser om at arbejde med feltprøver diskuteres også.
Cyanobakterier er en forskelligartet gruppe af fotosyntetiske, gramnegative bakterier, der spiller kritiske roller i globale økosystemer og tjener som væsentlige bioteknologiske modeller. Nyligt arbejde har vist, at både marine og ferskvandscyanobakterier producerer ekstracellulære vesikler – små membranbundne strukturer frigivet fra mikrobernes ydre overflade. Mens vesikler sandsynligvis bidrager til forskellige biologiske processer, forbliver deres specifikke funktionelle roller i cyanobakteriel biologi stort set ukendte. For at tilskynde til og fremme forskning på dette område præsenteres en detaljeret protokol til isolering, koncentration og rensning af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Det nuværende arbejde diskuterer metoder, der med succes har isoleret vesikler fra store kulturer af Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis. Metoder til kvantificering og karakterisering af vesikelprøver fra disse stammer præsenteres. Tilgange til isolering af vesikler fra akvatiske feltprøver er også beskrevet. Endelig diskuteres også typiske udfordringer med cyanobakterie vesikelrensning, metodologiske overvejelser for forskellige downstream-applikationer og afvejningerne mellem tilgange.
Ekstracellulære vesikler (IV’er) er sfæriske strukturer, der spænder mellem ~ 20-400 nm i diameter, frigivet af stort set alle organismer i deres omgivende miljø 1,2,3. Vesikler er afgrænset af et lipid dobbeltlag og kan ikke replikere sig selv. I gramnegative bakterier menes disse strukturer primært at opstå ved at ‘bløde’ små portioner fra den ydre membran. Alligevel kan andre processer, herunder flagellar bevægelse, cellelyse og sekretion af både indre og ydre membranmateriale, producere vesikler samt 4,5. ELBILER kan indeholde forskellige biomolekyler, herunder lipider, opløselige proteiner og membranproteiner, nukleinsyrer og metabolitter, og kan transportere dette materiale mellem celler 4,5,6. I betragtning af disse funktioner undersøges elbiler for at forstå deres mulige roller i en bred vifte af biologiske processer, herunder cellulær kommunikation, biofilmdannelse, vandret genoverførsel, værtsfagdynamik og næringsstofudveksling 4,6.
Cyanobakterier er en stor og forskelligartet gruppe af gramnegative bakterier, herunder encellede og trådformede organismer. De er af interesse fra mange perspektiver, herunder forståelse af deres fysiologi og mangfoldighed 7,8, de kritiske økosystemfunktioner, de tjener 9,10, og deres anvendelighed til bioteknologi11,12. Cyanobakterier findes i en lang række levesteder, enten som fritlevende organismer i marine, ferskvands- og terrestriske miljøer eller i symbiotiske foreninger med moser, bregner, planter eller i lav og svampe13. De tjener som afgørende primærproducenter i akvatiske økosystemer, der producerer ilt og organisk kulstof gennem oxygenisk fotosyntese 9,10, og nogle er også i stand til at fiksere atmosfærisk nitrogen7. Marine og ferskvandscyanobakterier, herunder Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis, producerer elbiler under laboratoriebetingelser 14,15,16, og cyanobakterielle vesikler kan også findes i naturlige miljøer 14,17. De biologiske og økologiske funktioner af cyanobakterielle vesikel er ukendte, men yderligere forskning på dette område vil sandsynligvis give ny indsigt i spørgsmål om cyanobakteriel fysiologi, differentiering, kommunikationsstrategier, evolution og trofiske interaktioner. Desuden kan cyanobakterielle elbilers evne til at transportere forskellige kategorier af biomolekyler have kommercielle anvendelser18,19.
Den foreliggende protokol beskriver metoder til isolering og karakterisering af vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver for at muliggøre og tilskynde til en bredere undersøgelse af cyanobakteriel ekstracellulær vesikelbiologi. Mens arbejdsgangen beskrevet her er analog med protokoller til isolering og karakterisering af elbiler fra andre bakterier, indeholder cyanobakterielle kulturer og feltprøver typisk lavere celle- og vesikelkoncentrationer, end der almindeligvis observeres med værtssammenhæng eller patogene modelsystemer 20,21,22. Undersøgelser af cyanobakterielle elbiler kræver således særlige overvejelser og optimeringer til dyrkning og vesikkelisolering, som varierer yderligere mellem stammer og mediebaggrunde. Da ingen enkelt protokol vil fungere lige så godt for alle stammer, vækstbetingelser og downstream-applikationer, giver vi flere muligheder og diskuterer de involverede kompromiser, så forskere kan bestemme de tilgange, der er mest hensigtsmæssige til at løse deres eksperimentelle spørgsmål.
Generelle betragtninger
Protokollen (figur 1) præsenteres som et sæt muligheder for at fremhæve, at der ikke findes nogen “one-size-fits-all”-metode til at arbejde med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Interesserede forskere kan udnytte de dele af denne protokol, der er kompatible og passende for deres særlige modelorganisme, eksperimentelle spørgsmål / mål og udstyrstilgængelighed. Alle vesikkelisoleringsmetoder involverer afvejninger og vil uundgåeligt resultere i en vis grad af bias. Mens man bør søge at minimere dette, når det er muligt, er den mest afgørende overvejelse at sikre, at den anvendte detaljerede metode rapporteres i henhold til relevante MISEV-retningslinjer (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.
Kultur vækst
Cyanobakterielle kulturer kan let fås fra en af de mange kultursamlinger, der er tilgængelige over hele verden. Et par eksempler er Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrig), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankrig) og Provasoli-Guillard National Center for Marine Alger and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den valgte cyanobakterielle stamme skal dyrkes under de relevante medium- og miljøforhold, der varierer betydeligt mellem forskellige stammer. En liste over almindeligt anvendte medier til cyanobakteriel dyrkning kan findes på kulturindsamlingswebsteder eller andre publikationer 37,38,39.
Arbejde med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler giver nogle unikke udfordringer sammenlignet med de metoder, der er rapporteret for mange typiske modellaboratorieheteretertotrofer. Cyanobakterielle kulturer har vesikelkoncentrationer af størrelsesordener lavere end dem, der findes i andre mikrober, såsom Escherichia coli 14,16,40. Disse forskelle, der formodentlig skyldes lavere celletætheder og/eller vesikelproduktionshastigheder, betyder, at relativt store kulturer (~ 1-20 l eller mere) kan være nødvendige for at give tilstrækkeligt materiale til bulkanalyser. Således opfordres forskere til at teste vesikkeludbytter fra mindre kulturer for at bestemme, hvor meget materiale der vil være nødvendigt for at nå deres ønskede slutmål. Betydningen af at fastslå, om det medie, der anvendes til forsøget, har en påviselig partikelbaggrund, skal også understreges, inden et forsøg påbegyndes, da dette materiale potentielt kan forvirre vesiklepopulationskvantificeringen, reducere følsomheden af vesiklatkoncentrations-/størrelsesmålinger eller forurene de endelige vesiklpræparater.
En anden udfordring for feltet er, at ikke alle cyanobakterier vokser godt, eller overhovedet, i ren kultur. Indtil de er gjort axeniske, kan fortolkninger af fysiske vesikleegenskaber, produktionshastigheder eller indhold ikke nødvendigvis føre til klare konklusioner om vesikler produceret af en enkelt stamme i samfundet. Forskere rådes også til at overveje, hvilke andre typer partikler der kan være til stede og potentielt forveksles med vesikler ved hjælp af specifikke nanopartikelanalyseværktøjer, som ikke nødvendigvis kan diskriminere mellem forskellige partikeltyper. Det kan f.eks. være vigtigt at kontrollere, at den stamme, der anvendes, mangler en profag, enten via genomsekventering, induktionsassays eller andre midler eller ikke frigiver andre typer partikler. Efter vores erfaring er de fleste cyanobakterielle vesikler <0,2 μm i diameter, men når man ser på en ny stamme eller væksttilstand, skal man bekræfte, om brug af et 0,45 μm porestørrelsesfilter ændrer størrelsesfordelingen af rensede partikler.
Mange aspekter af kulturforholdene kan påvirke vesikelproduktionen og dens indhold41,42. De fysiske og kemiske forhold, der anvendes til dyrkningsvækst (herunder lysindstråling, temperatur og mediesammensætning), skal således dokumenteres og kontrolleres i det omfang, det er muligt for at sikre resultaternes reproducerbarhed. Enhver kemisk analyse af vesiklenindholdet skal tage højde for baggrundssammensætningen, navnlig når der udføres analyser i »-omics«-stil med høj kapacitet. Dette kan være særligt kritisk, når du bruger udefinerede medier, såsom dem, der er baseret på en naturlig havvandsbaggrund eller suppleret med gærekstrakt eller tryptone. Brug af et defineret vækstmedium kan være at foretrække afhængigt af de eksperimentelle mål.
Forskere skal nøje overvåge kulturvækstdynamikken med jævne mellemrum for at sikre, at de ved, hvor i vækstfasen en given batchkultur er, og ikke kun indsamle prøver efter en vilkårlig tid. Vesikkelsammensætningen kan variere på tværs af vækstfaser, især mellem eksponentielle og stationære faser41,42. For eksempel kan i det mindste en brøkdel af vesiklerne, der udtages i den stationære fase, opstå fra en anden cellulær mekanisme, såsom cellelyse, der ikke vil forekomme under eksponentiel vækst. Selvom dette stadig kan være af stor biologisk interesse, er det vigtigt at kende prøven. Hvis en cyanobakteriel kultur når den ønskede vækstfase på et tidspunkt, hvor det ikke er muligt at gå direkte til prøvekoncentrationen, anbefales det straks at adskille cellerne fra fraktionen <0,2 μm (med centrifugering og/eller direkte 0,2 μm filtrering) og derefter opbevare det cellefrie filtrat ved 4 °C. Materialet kan opbevares på denne måde i dagevis med ringe eller ingen mærkbar indvirkning på koncentrationen eller størrelsesfordelingen af vesikler.
Vesikkelrensninger
Det hyppige behov for at isolere vesikler fra signifikante volumenkulturer er afgørende i den cyanobakterielle vesikelisoleringsarbejdsgang. Når du arbejder med større mængder materiale, skal vesiklerne koncentreres før downstream-separationsarbejdsgange. Koncentratorer (tangentielle flowfiltermembraner eller centrifugalkolonner) med en nominel molekylvægtsgrænse på 100 kDa anbefales generelt, da de tillader adskillelse fra opløseligt materiale med lav molekylvægt, samtidig med at koncentrationstiderne holdes rimelige, men 30 kDa-filtre anvendes også ofte med succes. Mens flere ikke-ultracentrifugationsbaserede metoder til rensning af vesikler (f.eks. Størrelsesudelukkelseskromatografi, mikrofluidiske baserede systemer, affinitetsfangstteknikker og nedbørsbaserede tilgange) bliver populære inden for det ekstracellulære vesikelfelt, er det vores erfaring, at disse tilgange kan resultere i reducerede udbytter og typisk er uforenelige med de nødvendige kulturmængder.
Forskere skal overveje sammensætningen af iodixanolbaggrunden og de vaske-/resuspensionbuffere, der anvendes under vesikkelrensning for at sikre, at de er kompatible med de ønskede downstream-applikationer. I mange tilfælde kan den endelige vesikelprøve resuspenderet i vækstmedier eller en defineret buffer, der i sammensætning kan sammenlignes med vækstmediet (f.eks. naturligt vs. kunstigt havvand). Dette er dog muligvis ikke muligt med marine cyanobakterielle vesiler, hvilket vil kræve yderligere eksperimentel manipulation til analyse, da høje saltkoncentrationer svarende til havvandsniveauer kan hæmme mange enzymatiske reaktioner. I sådanne tilfælde fungerer standardlaboratoriebuffere såsom 0,2 μm filtreret, 1x PBS typisk godt til opretholdelse af stabiliteten af marine cyanobakterielle vesikel og kan være mere kompatible med nedstrøms eksperimentelle processer.
Tæthedsgradientrensning kan betragtes som valgfri afhængigt af forsøgsmålene og kultursammensætningen, men anbefales kraftigt til fremstilling af en strengere ren og reproducerbar prøve. EV-populationer er heterogene og kan findes på tværs af en række opdriftstætheder, som yderligere varierer efter stamme, vækstbetingelser og andre faktorer 4,5,6. De ovennævnte tætheder repræsenterer dem, der typisk findes for vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver i iodixanol, men resultaterne i andre stammer kan variere. Andre densitetsgradientmaterialer som saccharose og CsCl kan anvendes til vesikler, men de vil migrere til forskellige opdriftstætheder i disse baggrunde. Forskellige gradientmediebaggrunde kan skævvride genopretningen af lipidlukkede vira43 og kan potentielt påvirke genopretningen af vesikler fra forskellige stammer.
Vesikler kan gå tabt på flere punkter gennem vesikkelisoleringen og gradientrensningsprocessen, der er beskrevet her, hvilket reducerer udbyttet og øger mængden af udgangsmateriale, der er nødvendigt for at opnå et givet endeligt vesikleudbytte til downstream-applikationer. Der skal udvises særlig forsigtighed, når man arbejder med vesikpellets efter ultracentrifugation. Mens nogle cyanobakterielle vesikler kan have carotenoider eller andre forbindelser, som kan give vesikkelprøver en vis mængde pigmentering (figur 2), afhængigt af stammen eller mængden af materiale, forventes det ikke nødvendigvis at være i stand til at visualisere vesiklerne pellet direkte. Vær opmærksom på, hvor pillen forventes at få den anvendte type centrifugerotor. Når det er muligt, foreslås det, at rensede vesikelprøver undersøges ved elektronmikroskopi for at verificere sammensætningen af det genvundne endelige materiale.
Opbevaringsbetingelsernes indvirkning på vesikler og deres indhold er fortsat et åbent spørgsmål. Selv om det konstateres, at opbevaringen ikke har en bemærkelsesværdig effekt på cyanobakterielle vesiklerstørrelse eller koncentration14, kan funktionaliteten af isolerede vesikelpræparater ændre sig over tid44. Selv om fryse-/optøningscyklusser bør undgås, når det er muligt, synes virkningen af frysning af prøver på det samlede vesikantal og -størrelser at være minimal. Man bør være opmærksom på potentialet for fryse-optøningscyklusser for at påvirke sammensætningen af vesikelindholdet, såsom længden af vesikle-associerede nukleinsyrer eller stabiliteten af proteiner.
Vesikler fra field srigelige
Nuværende metoder til isolering af ekstracellulære vesikler fra naturlige vandmiljøer svarer konceptuelt og operationelt til dem, der er beskrevet her for store volumenkulturer. Alligevel kan de kræve endnu større mængder materiale. Sådanne feltprøver kan involvere indsamling, filtrering og koncentration af hundreder til tusinder af liter vand for at opnå tilstrækkeligt materiale til analyse. Afhængigt af turbiditeten af den prøve, der anvendes, kan det være nødvendigt at indarbejde et eller flere forfiltreringstrin før filteret på 0,2 μm. Den specifikke TFF-anordning, der anvendes, bør være egnet til at arbejde med så store mængder inden for en rimelig tid (ideelt set i timerækkefølgen) og uden at lægge for stort pres på prøven. I praksis indebærer dette ofte at bruge et meget større samlet overfladeareal, end der kan anvendes på kulturbaserede prøver, samt slanger med større diameter for at lette øgede strømningshastigheder. Dette øgede filteroverfladeareal vil sandsynligvis føre til en marginal stigning i partikeltab sammenlignet med mindre TFF-ordninger og et større endeligt koncentratvolumen; Disse betænkeligheder skal dog afvejes med hensynet til den samlede sagsbehandlingstid. I situationer som f.eks. et udvidet oceanografisk krydstogt, hvor prøverne ikke vender tilbage til et laboratorium i mange dage efter prøveudtagningen, anbefaler vi, at der udføres indledende 0,2 μm filtrerings- og TFF-trin i marken. Dette mindre volumen koncentreret materiale kan derefter opbevares ved 4 °C eller -80 °C om bord (afhængigt af tilgængeligheden og nedstrøms analytiske overvejelser), indtil det returneres til laboratoriet med henblik på endelig behandling.
Isolering og adskillelse af ekstracellulære vesikler fra andre små partikler, både organiske og uorganiske, kan være udfordrende, og metoder til adskillelse af forskellige partikler er endnu ikke perfekte. For eksempel kan iodixanoldensitetsgradienter ikke let adskille alle klasser af vesikler og vira, der er til stede i en given prøve. Da typerne af forvirrende partikler og deres fysiske egenskaber vil variere mellem prøveudtagningssteder, er det i øjeblikket umuligt at tilvejebringe en protokol, der robust opdeler alle klasser af små akvatiske partikler. Forsøg og fejl er afgørende, og eksperimentering med iodixanolområdet, der anvendes i gradient- og ultracentrifugationsbetingelserne, vil være påkrævet for at maksimere adskillelsen; en samling af mindre volumen, mere fint opløste densitetsfraktioner kan også være påkrævet. Afhængigt af konteksten kan brug af CsCl-gradienter i stedet for iodixanol hjælpe med at adskille miljøpartikler45. Alligevel kan ændringen i osmotiske forhold føre til forstyrrelser i de endelige genvundne produkter, som diskuteret ovenfor.
Vesikel karakterisering
Nanopartikelanalyseinstrumenter er endnu ikke rutinemæssigt tilgængelige i mikrobiologiske laboratorieindstillinger, men bliver stadig mere tilgængelige. Alle metoder har fordele og ulemper, og vi giver ingen specifik godkendelse af en platform som værende bedre end alle andre til cyanobakterielle vesiklerarbejde; faktisk har alle særlige afvejninger med hensyn til omkostninger, opløsning, brugervenlighed, detektionsgrænser, kompatibilitet med forskellige vækstmedier / bufferbaggrunde og datareproducerbarhed. Ud over instrumenter baseret på nanopartikelsporingsanalyse beskrevet ovenfor kan andre tilgange, herunder nanoflowcytometri, mikrofluidisk resistiv pulsføling og justerbar resistiv pulsføling, anvendes46,47. Brugere bør være forsigtige med at lære detaljerne i deres tilgængelige instrumentering og kontrollere, at det fungerer godt med deres system, da vi har stødt på vanskeligheder, når vi bruger nogle platforme med havvandsbaserede medier. Vi opfordrer feltet til at bevæge sig mod kvantitativ karakterisering af vesikelstørrelse, koncentrationer og produktionshastigheder. Måling af vesikelkoncentrationer på basis af en grundlæggende partikel pr. ml og ikke med hensyn til proteinindhold eller andre målinger vil gøre det muligt at integrere vesikler i mere kvantitative rammer og muliggøre sammenligninger mellem stammer og tilstande. Der er behov for en yderligere indsats for at forbedre evnen til at kalibrere koncentrationsmålinger for <100nm partikler.
Det faktum, at målinger af vesikelproduktionshastighed udføres direkte fra 0,2 μm filtreret kultursupernatant for at minimere partikeltab, ville være forbundet med andre rensningstrin beskrevet ovenfor. Dette betyder dog, at tilgangen ikke nødvendigvis diskriminerer mellem faktiske ekstracellulære vesikler og andre små partikler, der findes i kulturerne. Kun optælling af partikler inden for bestemte størrelsesintervaller (f.eks. 50-250 nm diameter) kan bidrage til at udelukke nogle outliers, men visuel bekræftelse af, at pelleteret <0,2 μm kulturindhold synes at være membranbundne vesikler (ved TEM eller andre tilgange) er nødvendig for specifikt at kunne hævde, at man måler produktionen af vesikler i modsætning til produktionen af vesiklelignende partikler.
En væsentlig faktor i vesikelkarakterisering er at sikre, at vesikelprøven analyseres i det passende lineære følsomhedsområde for nanopartikelanalyseanordningen. Når en prøve er for koncentreret, er det ligetil at fortynde materialet med en ren buffer og analysere det igen. På den anden side kan den relativt lave celle- og/eller vesicletæthed i nogle cyanobakterielle kulturer undertiden give vesikelpræparater, der ligger under nogle instrumenters detektionsgrænser. I tilfælde, hvor dette sker med bulk vesikelrensninger, kan man overveje at dyrke større volumenkulturer, genpelletering og genbrug af det endelige materiale i et mindre volumen eller vurdere, om der er et trin i isolationsprocessen, hvor der forekommer for store tab og kan afbødes. Ved måling af vesikleproduktionshastigheder er rettelserne ikke nødvendigvis så ligetil. Prøver kan koncentreres, hvis det er nødvendigt, men den første skal se, om justeringer af mediet kan resultere i højere celletætheder, eller om der kan opnås tilstrækkeligt koncentrerede prøver fra senere tidspunkter i den eksponentielle fase, hvor koncentrationerne vil være højere.
Begrænsninger
Som med enhver protokol har vesikelisolering ved hjælp af disse tilgange klare begrænsninger. Disse tilgange er ikke afhængige af deres garanti for, at en fuldstændig ren fremstilling af vesikler vil blive isoleret. Både kulturer og feltprøver kan indeholde andre materialer, som migrerer på samme måde som vesikler i densitetsgradienter. Alligevel er disse typer af yderligere oprensningsmetoder i det mindste afgørende for at sikre strenghed og reproducerbarhed af vesikelanalyse. Mens vi beskriver vesikkelisoleringsmetoder i forbindelse med cyanobakterier, vil kulturer af mange andre mikrober også indeholde vesikler i forholdsvis lave koncentrationer, og de procedurer, der er beskrevet her, bør være generelt anvendelige. Det forventes, at disse metoder ikke vil tjene som en permanent protokol, men i stedet som udgangspunkt for at anspore fremtidige fremskridt i arbejdet med ekstracellulære vesikler fra forskellige mikrober. Der er behov for en fremtidig indsats for at fusionere disse metoder med andre tilgange såsom kolonner til udelukkelse af størrelse eller asymmetrisk feltstrømfraktionering for at forbedre forskelsbehandlingen og adskillelsen af forskellige kategorier af små partikler fra kulturer og miljøprøver. Vi håber også, at disse teknikker kan fortsætte med at udvikle sig sammen med forbedringer i nanopartikelkarakteriseringsteknologier for at forbedre evnen til at undersøge heterogenitet inden for vesikelpopulationer, deres indhold og deres nøjagtige funktionelle roller i miljøet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender støtten fra i3S Scientific Platforms “Biointerfaces and Nanotechnology” og “Histology and Electron Microscopy”, et medlem af den nationale infrastruktur Portugisisk Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi takker også professor J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spanien) for at hjælpe med at optimere den ultratynde sektionsfarvningsprotokol for TEM og Dr. Cecília Durães og Dr. Ana Rita Pinto (University of Porto, Portugal) for nanopartikelsporingsanalysen.
Dette arbejde blev finansieret af US National Science Foundation (OCE-2049004 til SJB), af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fonde gennem COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, og af portugisiske midler gennem Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inden for rammerne af projektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 til PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia er også stærkt anerkendt for ph.d.-stipendiet SFRH/BD/130478/2017 (SL) og FCT Investigator grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.-M. blev støttet af et individuelt Marie Skłodowska-Curie-stipendium (reintegrationspanel) inden for rammerne af Horisont 2020-rammeprogrammet (Horisont 2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Home-made buffer | — | Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially |
2% Uranyl acetate solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | Negative staining – TEM |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining |
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) | Merck | UFC9100XX | Alternative option for centrifugal ultrafiltration |
BG11 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803 |
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu | Electron Microscopy Sciences | 71150 | Transmission electron microscopy (TEM) grid |
easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000 | Commercial TEM grid glow discharger |
EMbed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Ultra-thin sections – TEM |
Filter holder for vacuum system | Thermo Fisher Scientific | 300-4000 | Reusable units with filter membrane support plates |
Glutaraldehyde Grade I | Sigma-Aldrich | G5882-10X1ml | Ultra-thin sections – TEM |
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] | Sigma-Aldrich | H7006 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Lead Citrate, Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | Stain for use in electron microscopy |
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K | Pall | MAP100C36 | For centrifugal ultrafiltration of small volume samples |
Millipore Pellicon 3 TFF Module | EMD Millipore | XX42P0060 or XX42P0080 | Alternative TFF option for concentrating large volume samples |
Milli-Q Reference Water Purification System | Merck | Z00QSV0WW | Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water |
NanoSight | Malvern Panalytical | LM14 or NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
Optima L80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L80 XP | Ultracentrifuge (or similar model) |
OptiPrep / Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Density gradient media |
Osmium Tetroxide Reagent Plus | Sigma-Aldrich | 201030 | Ultra-thin sections – TEM |
Pall Centramate PE TFF holder | Pall Corporation | FS002K10 | TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes |
Peristaltic pump Masterflex L/S | Cole-Parmer | 07559-07 | Pump for driving large-scale TFF modules |
Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments | 152-001 | Automated density gradient fractionation |
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 355618 | Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly |
Pro99 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Prochlorococcus |
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | P20495 | LPS staining |
SN medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250-100G | Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM |
SW32Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
SW60Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 335650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes |
Syringe 1mL Luer | BD Plastipak | 303172 | For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment |
Syringe filter 0.2 µm | Pall Corporation | 4602 | For vesicle isolation from cultures |
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | T5130 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Or similar microscope |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
Type XIV protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining |
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 344058 | Single use ultracentrifuge tubes |
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 344062 | Single use ultracentrifuge tubes |
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC | RMC Products, Boeckeler Instruments | 75501 | Microtome for ultra-thin sections – TEM |
Universal 320 R centrifuge | Hettich | Z654736 | This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells |
Vacuum apparatus | KNF Neuberger | N026.3 AT.18 | Or any similar vacuum pump and trap |
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES | Sartorius | VF20P4 | TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1). |
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) | Cytiva | 6717-9502 | Capsule filter for filtering large volumes of liquid |
Zetasizer | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | Dynamic light scattering (DLS) instrument |