Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller
Summary
Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.
Abstract
El equilibrio redox tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) promueve la modificación de proteínas, lípidos y ADN, lo que finalmente puede conducir a la alteración de la función celular y la muerte celular. Por lo tanto, es beneficioso para las células aumentar su defensa antioxidante en respuesta a insultos perjudiciales, ya sea activando una vía antioxidante como Keap1 / Nrf2 o mejorando los eliminadores redox (vitaminas A, C y E, β caroteno y polifenoles, entre otros). La inflamación y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis y progresión de las retinopatías, como la retinopatía diabética (RD) y la retinopatía del prematuro (ROP). Dado que las células gliales de Müller (MGC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido retiniano neural, se consideran un modelo ideal para estudiar estos mecanismos de protección celular. En este sentido, cuantificar los niveles de ROS con un método reproducible y sencillo es fundamental para valorar el aporte de vías o moléculas que participan en el mecanismo de defensa celular antioxidante. En este artículo, proporcionamos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de ROS con sonda DCFH-DA y citometría de flujo en MGC. Aquí se proporcionan pasos clave para el procesamiento de datos de citometría de flujo con el software, por lo que los lectores podrán medir los niveles de ROS (medios geométricos de FITC) y analizar histogramas de fluorescencia. Estas herramientas son muy útiles para evaluar no solo el aumento de ROS después de un insulto celular, sino también para estudiar el efecto antioxidante de ciertas moléculas que pueden proporcionar un efecto protector sobre las células.
Introduction
La retina neural es un tejido muy organizado que presenta capas neuronales bien definidas. En estas, las neuronas (células ganglionares, amacrinas, bipolares, horizontales y fotorreceptoras) están interconectadas entre sí y también con células gliales de Müller (MGC) y astrocitos, lo que lleva a una adecuada fototransducción y procesamiento de la información visual 1,2. Se sabe que los MGC tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis retiniana porque atraviesan toda la sección retiniana y, por lo tanto, pueden interactuar con todos los tipos de células que modulan múltiples procesos protectores. Se ha reportado que los MGC tienen varias funciones importantes para el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas retinianas, incluyendo la glucólisis para proporcionar energía a las neuronas, la eliminación de desechos neuronales, el reciclaje de neurotransmisores y la liberación de factores neurotróficos, entre otros 3,4,5.
Por otro lado, la inflamación, el estrés oxidativo y nitrosativo están implicados en la patogénesis y progresión de muchas enfermedades humanas, incluidas las retinopatías 6,7,8,9,10,11. El equilibrio redox en las células depende de una regulación estricta de los niveles de ROS. Las ROS se generan constantemente en condiciones fisiológicas como resultado de la respiración aeróbica principalmente. Los principales miembros de la familia ROS incluyen radicales libres reactivos como el anión superóxido (O2͘͘͘͘•−), radicales hidroxilo (•OH), varios peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) y el peróxido de hidrógeno sin radicales (H2O2)12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que las ROS desempeñan un importante papel de señalización en las células mediante el control de procesos esenciales. Los MGC tienen una fuerte defensa antioxidante por la activación del factor nuclear transcripcional eritroide-2 relacionado con el factor 2 (Nrf2) y la posterior expresión de proteínas antioxidantes para eliminar la producción excesiva de ROS en condiciones patológicas 14,15,16. Cuando las células pierden su equilibrio redox debido a una producción exagerada de ROS o una capacidad defectuosa para eliminar ROS, la acumulación de estrés oxidativo promueve modificaciones dañinas en proteínas, lípidos y ADN, lo que lleva al estrés celular o la muerte. El aumento del sistema de defensa antioxidante de la retina mejora la resolución y prevención de retinopatías, como roP y RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Por lo tanto, la medición de la producción de ROS en tiempo real es una herramienta poderosa y útil.
Existen varios métodos para medir la producción de ROS o el estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar directamente el estado redox de una célula 25,26,27,28. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite su escisión por esterasas intracelulares en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular, 2′,7′-diclorofluoresceína (H2DCF). Esta molécula no fluorescente se acumula intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente DCF. La oxidación de la sonda es producto de la acción de múltiples tipos de ROS (peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico o peróxidos), que pueden detectarse mediante citometría de flujo o microscopía confocal (emisión a 530 nm y excitación a 485 nm). La limitación de esta técnica es que el superóxido y el peróxido de hidrógeno no reaccionan fuertemente con H2DCF25,29. En este artículo, utilizamos la sonda DCFH-DA para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Por esa razón, inducimos la producción de ROS estimulando mgC con inductor de ROS, A o B, antes de cargar las células con la sonda fluorescente. Además, utilizamos un compuesto antioxidante. Finalmente, mostramos datos representativos y fiables obtenidos utilizando este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varias afecciones patológicas, como el cáncer, las enfermedades inflamatorias, la isquemia/reperfusión, la cardiopatía isquémica, la diabetes y las retinopatías, y también situaciones fisiológicas como el envejecimiento, conducen a la sobreproducción de ROS 6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, la detección, medición y comp…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a María Pilar Crespo y Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en citometría de flujo y a Gabriela Furlan y Noelia Maldonado por su asistencia en cultivo celular. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) y Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
Referencias
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
