Kvantifisering av reaktive oksygenarter ved bruk av 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe og Flow-Cytometry i Müller Glial Cells

Den nevrale netthinnen er et veldig organisert vev som presenterer veldefinerte nevronale lag. I disse er nevroner (ganglion, amacrine, bipolare, horisontale og fotoreseptorceller) koblet sammen med hverandre og også med Müller glialceller (MGCer) og astrocytter, noe som fører til tilstrekkelig fototransduksjon og behandling av visuell informasjon ^1,2. MGCer er kjent for å ha en viktig rolle i vedlikehold av retinal homeostase fordi de krysser hele netthinnedelen, og dermed kan de samhandle med alle celletyper som modulerer flere beskyttende prosesser. Det har blitt rapportert at MGCer har flere viktige funksjoner for vedlikehold og overlevelse av retinal nevroner, inkludert glykolyse for å gi energi til nevroner, fjerning av nevronalt avfall, resirkulering av nevrotransmittere og frigjøring av nevrotrofiske faktorer, blant annet ^3,4,5.

På den annen side er betennelse, oksidativt og nitrosativt stress involvert i patogenese og progresjon av mange menneskelige sykdommer, inkludert retinopatier ^{6,7,8,9,10,11}. Redoksbalansen i celler avhenger av stram regulering av ROS-nivåer. ROS genereres stadig under fysiologiske forhold som følge av aerob åndedrett hovedsakelig. De viktigste medlemmene av ROS-familien inkluderer reaktive frie radikaler som superoksid-anionen (O_2͘͘͘͘^•−), hydroksylradikaler (^•OH), ulike peroksider (ROOR′), hydroperoksider (ROOH) og ingen radikal hydrogenperoksid (_H2O₂)^12,13. De siste årene har det blitt tydelig at ROS spiller en viktig signalrolle i cellene ved å kontrollere viktige prosesser. MGC har et sterkt antioksidantforsvar ved aktivering av transkripsjonell kjernefysisk faktor erythroid-2-relatert faktor 2 (Nrf2) og det påfølgende uttrykket av antioksidantproteiner for å eliminere overdreven produksjon av ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellene mister sin redoksbalanse på grunn av en overdrevet produksjon av ROS eller en defekt evne til å fjerne ROS, fremmer opphopning av oksidativt stress skadelige modifikasjoner i proteiner, lipider og DNA, noe som fører til cellulær stress eller død. Økningen av retinal antioksidantforsvaret forbedrer oppløsningen og forebyggingen av retinopatier, som ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling av ROS-produksjon i sanntid et kraftig og nyttig verktøy.

Det finnes flere metoder for måling av ROS-produksjon eller oksidativt stress i celler. Blant disse er 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) sonde en av de mest brukte teknikkene for direkte kvantifisering av redokstilstanden til en celle 25,26,27,28. Denne sonden er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusjon av denne sonden over cellemembranen tillater spalting av intracellulære esteraser ved de to esterbindingene, og produserer et relativt polart og cellemembran-ugjennomtrengelig produkt, 2′,7′-dichlorofluorescein (H₂DCF). Dette ikke-fluorescerende molekylet akkumuleres intracellulært, og etterfølgende oksidasjon av ROS gir det svært fluorescerende produktet DCF. Oksidasjonen av sonden er produktet av virkningen av flere typer ROS (peroksynitritt, hydroksylradikaler, nitrogenoksid eller peroksider), som kan påvises ved strømningscytometri eller konfokal mikroskopi (utslipp ved 530 nm og eksitasjon ved 485 nm). Begrensningen av denne teknikken er at superoksid og hydrogenperoksid ikke reagerer sterkt med H₂DCF^25,29. I denne artikkelen bruker vi DCFH-DA-sonde for å måle og kvantifisere ROS ved strømningscytometri. Av den grunn induserer vi ROS-produksjon ved å stimulere MGCer med ROS-induser, A eller B, før vi laster cellene med fluorescerende sonde. I tillegg bruker vi en antioksidantforbindelse. Til slutt viser vi representative og pålitelige data innhentet ved hjelp av denne protokollen.