ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

神経網膜は、明確に定義されたニューロン層を提示する非常に組織化された組織である。これらの中で、ニューロン(神経節、アマクリン、双極性、水平、および視細胞)は、互いに、またミュラーグリア細胞(MGC)およびアストロサイトと相互接続され、適切な光伝達および視覚情報の処理をもたらす^1,2。MGCは、網膜部分全体にわたっており、したがって、複数の保護プロセスを調節するすべての細胞型と相互作用することができるため、網膜恒常性の維持に重要な役割を果たすことが知られている。MGCは、ニューロンにエネルギーを供給する解糖系、ニューロン老廃物の除去、神経伝達物質のリサイクル、神経栄養因子の放出など、網膜ニューロンの維持と生存のためにいくつかの重要な機能を有することが報告されている^3,4,5。

一方、炎症、酸化ストレスおよびニトロソストレスは、網膜症⁶、⁷、⁸、⁹、¹⁰、¹¹を含む多くのヒト疾患の病因および進行に関与している。細胞内の酸化還元バランスは、ROSレベルの厳密な調節に依存する。ROSは、主に好気呼吸の結果として生理学的条件下で絶えず生成される。ROSファミリーの主要メンバーには、スーパーオキシドアニオン(O_2͘͘͘^•−)、ヒドロキシルラジカル(^•OH)、様々な過酸化物(ROOR’)、ヒドロペルオキシド(ROOH)、および無ラジカル過酸化水素(_H2O2)^12,13などの反応性フリーラジカルが含まれる。ここ数年で、ROSが重要なプロセスを制御することによって細胞内で重要なシグナル伝達役割を果たすことが明らかになりました。MGCは、転写核因子エリスロイド-2関連因子2(Nrf2)の活性化およびその後の抗酸化タンパク質の発現によって強力な抗酸化防御を有し^、病理学的条件下でのROSの過剰産生を排除する¹⁴、^15、16。ROSの誇張された産生またはROSを除去する能力の欠陥のために細胞が酸化還元バランスを失うと、酸化ストレスの蓄積はタンパク質、脂質、およびDNAの有害な修飾を促進し、細胞ストレスまたは死に至る。網膜抗酸化防御系の増加は、ROPおよびRD17、18、¹⁹、20、²¹、^22、23、²⁴などの網膜障害の分解能および予防を改善する。したがって、リアルタイムでのROS生産の測定は強力で便利なツールです。

細胞内のROS産生または酸化ストレスを測定するためのいくつかの方法がある。これらの中でも、2′,7′-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)プローブは、細胞^{25、26、27、28}の酸化還元状態を直接定量するために最も広く使用されている技術の1つである。このプローブは親油性であり、非蛍光性である。細胞膜を横切るこのプローブの拡散は、2つのエステル結合における細胞内エステラーゼによる切断を可能にし、比較的極性が高く細胞膜不透過性の生成物である2′,7′-ジクロロフルオレセイン(_H2DCF)を生成する。この非蛍光分子は細胞内に蓄積し、その後のROSによる酸化は高蛍光生成物DCFを生成する。プローブの酸化は、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡(530nmでの発光および485nmでの励起)によって検出することができる複数のタイプのROS(ペルオキシ亜硝酸塩、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、または過酸化物)の作用の産物である。この技術の限界は、スーパーオキシドおよび過酸化水素が_H2DCF^25,29と強く反応しないことである。この記事では、DCFH-DAプローブを使用して、フローサイトメトリーによってROSを測定および定量します。そのため、蛍光プローブを細胞に負荷する前に、MGCをROS誘導剤AまたはBで刺激することにより、ROS産生を誘導します。また、酸化防止剤化合物を使用しています。最後に、このプロトコルを使用して得られた代表的で信頼性の高いデータを示します。