כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

הרשתית העצבית היא רקמה מאורגנת מאוד המציגה שכבות עצביות מוגדרות היטב. באלה, נוירונים (גנגליון, amacrine, דו קוטבי, אופקי, ותאי photoreceptor) מחוברים זה לזה וגם עם תאי גליה מולר (MGCs) ואסטרוציטים, מה שמוביל פוטו-טרנסדוקציה נאותה ועיבוד של מידע חזותי ^1,2. MGCs ידועים יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס רשתית כי הם חוצים את כל קטע הרשתית, ולכן, הם יכולים לקיים אינטראקציה עם כל סוגי התאים כי לווסת תהליכי הגנה מרובים. דווח כי MGCs יש מספר פונקציות חשובות לשמירה והישרדות של נוירונים ברשתית, כולל גליקוליזה כדי לספק אנרגיה נוירונים, הסרת פסולת עצבית, מיחזור של נוירוטרנסמיטורים, ושחרור של גורמים נוירוטרופיים, בין היתר ^3,4,5.

מצד שני, דלקת, עקה חמצונית וניטרוסיבית מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של מחלות אנושיות רבות, כולל רטינופתיות ^{6,7,8,8,9,10,11.} מאזן redox בתאים תלוי רגולציה הדוקה של רמות ROS. ROS נוצרים כל הזמן בתנאים פיזיולוגיים כתוצאה של נשימה אירובית בעיקר. החברים העיקריים במשפחת ROS כוללים רדיקלים חופשיים תגובתיים כגון אניון סופראוקסיד (O_2͘͘͘͘^•−), רדיקלים הידרוקסיל (^•OH), מי חמצן שונים (ROOR′), הידרופרוקסידים (ROOH), ומי חמצן ללא רדיקלי (H₂O₂)^12,13. בשנים האחרונות, התברר כי ROS ממלא תפקיד איתות חשוב בתאים על ידי שליטה בתהליכים חיוניים. MGCs יש הגנה נוגדת חמצון חזקה על ידי הפעלת גורם גרעיני תמלול אריתרויד-2 הקשורים גורם גורם 2 (Nrf2) ואת הביטוי הבא של חלבונים נוגדי חמצון כדי לחסל את הייצור המופרז של ROS בתנאים פתולוגיים 14,15,16. כאשר התאים מאבדים את שיווי המשקל שלהם עקב ייצור מוגזם של ROS או יכולת פגומה להסיר ROS, הצטברות של עקה חמצונית מקדמת שינויים מזיקים בחלבונים, שומנים, ו- DNA, המובילים ללחץ תאי או למוות. הגידול של מערכת ההגנה נוגדת החמצון ברשתית משפר את הרזולוציה ומניעה של רטינופתיות, כגון ROP ו RD 17,18,19,20,20,21,22,23,24. לכן, המדידה של ייצור ROS בזמן אמת היא כלי רב עוצמה ושימושי.

ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר לכימות ישיר של מצב redox של תא 25,26,27,28. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את המחשוף שלה על ידי אסטראזות תאיות בשני קשרים אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום, 2 ′,7′-dichlorofluorescein (H₂DCF). מולקולה לא פלואורסצנטית זו מצטברת באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את DCF המוצר הפלואורסצנטי ביותר. החמצון של הגשושית הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS (peroxynitrite, רדיקלים הידרוקסיל, תחמוצת החנקן, או מי חמצן), אשר ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלי (פליטה ב 530 ננומטר עירור ב 485 ננומטר). המגבלה של טכניקה זו היא כי סופראוקסיד ומי חמצן אינם מגיבים בעוצמה עם H₂DCF^25,29. במאמר זה, אנו משתמשים בדיקה DCFH-DA כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מסיבה זו, אנו גורמים לייצור ROS על ידי גירוי MGCs עם ממריץ ROS, A או B, לפני טעינת התאים עם בדיקה פלואורסצנטית. בנוסף, אנו משתמשים בתרכובת נוגדת חמצון. לבסוף, אנו מציגים נתונים מייצגים ואמינים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה.