Burada, Aeromonas’ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.
Prokaryotlarda glikozilasyon çalışması hızla büyüyen bir alandır. Bakteriler, yüzeylerinde glikanları suşa özgü bir barkod oluşturan farklı glikozile yapılar barındırır. İlişkili glikanlar, şeker bileşiminde ve yapısında ökaryotlarınkinden daha yüksek çeşitlilik gösterir ve bakteriyel-konakçı tanıma süreçlerinde ve çevre ile etkileşimde önemlidir. Patojenik bakterilerde, glikoproteinler enfeksiyöz sürecin farklı aşamalarında yer almıştır ve glikan modifikasyonları glikoproteinlerin spesifik fonksiyonlarına müdahale edebilir. Bununla birlikte, glikan bileşiminin, yapısının ve biyosentez yolaklarının anlaşılmasında kaydedilen ilerlemelere rağmen, glikoproteinlerin patojenite veya çevre ile etkileşimdeki rolünün anlaşılması çok sınırlı kalmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde, protein glikozilasyonu için gerekli enzimler, lipopolisakkarit ve kapsül biyosentetik yollar gibi diğer polisakkarit biyosentetik yollarla paylaşılır. Glikozilasyonun fonksiyonel önemi, glikozilasyon sürecine dahil olduğu düşünülen spesifik genlerin mutasyonu ve hedef glikoprotein ve modifiye edici glikan’ın ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi yoluyla birçok bakteride açıklığa kavuşturulmuştur. Mezofilik Aeromonas tek ve O-glikozile polar flagelluma sahiptir. Flagellar glikanlar, karbonhidrat bileşiminde ve Aeromonas suşları arasındaki zincir uzunluğunda çeşitlilik gösterir. Bununla birlikte, bugüne kadar analiz edilen tüm suşlar, serin veya treonin kalıntılarını değiştiren bağlantı şekeri olarak bir pseudaminik asit türevi göstermektedir. Pseudaminik asit türevi polar flagella montajı için gereklidir ve kaybının yapışma, biyofilm oluşumu ve kolonizasyon üzerinde etkisi vardır. Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, null mutantların yapımının, bir flagellar glikan’ın biyosentezinde varsayılan glikoziltransferazlar içeren genlerin veya genom bölgelerinin katılımını anlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu, ilgili glikoziltransferazların işlevini ve glikan’ın rolünü anlama potansiyelini içerir. Bu, glikan eksikliği olan mutantı vahşi tip suşla karşılaştırarak elde edilecektir.
Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan’ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur 1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon 3. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X’in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.
Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir4. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon 5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir7.
Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir 8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.
Glikoziltransferazlar (GT’ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT’ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir10. Bu nedenle, GT’leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)11, GT’leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT’nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir13,14, 3) fonksiyonel GT’lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT’lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.
Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri1. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin’lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni’de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi15,16’ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)17 tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas’ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit20’ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.
Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni16, H. pylori17 ve Aeromonas sp. 21, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. 15 flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir16. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm22 oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella’nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa’da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan23’ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.
Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar24. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum’a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir25. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında20 çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.
Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan’ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT’lerde veya GT’leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas’ın GT’lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan’ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan’ın rolünü belirlemek için belirli bir GT’nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT’lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.
Bu yöntemin kritik erken adımı, flagella ve varsayılan GT’lerin glikozilasyonunda yer alan bölgelerin tanımlanmasıdır, çünkü bu enzimler yüksek homoloji gösterir ve birçok süreçte yer alır. Aeromonas genomlarının halka açık veri tabanlarındaki biyoinformatik analizi, bu bölgenin birçok suşta flagellin genlerini içeren ve pseudaminik asit27’nin biyosentezinde rol oynayan genleri içeren polar flagella bölgesi 2’ye bitişik olduğunu göstermektedir. Bu, Aerom…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi tarafından, Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) için desteklenmiştir.
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |