Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan’ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur ^1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon ³. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X’in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.

Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir⁴. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon ^5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir⁷.

Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir ^8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.

Glikoziltransferazlar (GT’ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT’ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir¹⁰. Bu nedenle, GT’leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)¹¹, GT’leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT’nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir^13,14, 3) fonksiyonel GT’lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT’lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.

Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri¹. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin’lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni’de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi^15,16’ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)¹⁷ tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler^18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas’ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit^20’ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.

Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 ve} Aeromonas sp. ²¹, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. ¹⁵ flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir¹⁶. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm²² oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella’nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa’da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan^23’ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.

Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar²⁴. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum’a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir²⁵. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında²⁰ çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.

Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan’ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT’lerde veya GT’leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas’ın GT’lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan’ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan’ın rolünü belirlemek için belirli bir GT’nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT’lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.