פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.
אספקת תרופות למוח נותרה אתגר בשל התכונות הספציפיות והמגבילות של מחסום הדם-מוח (BBB), השולטות ומגבילות את הגישה לפרנכימה המוחית ומגבילות אותה. עם זאת, עם התפתחות הננו-טכנולוגיות, פותחו פאנלים גדולים של ננו-חומרים חדשים כדי לשפר את אספקת התרופות, מה שמדגיש את הצורך במיקרו-מערכות אמינות במבחנה כדי לחזות חדירה למוח במסגרת של מבחנים פרה-קליניים. הנה שיטה פשוטה להקמת מערכת מיקרופיזיולוגית שתדגים את ה-BBB תוך שימוש בתאים אנושיים בלבד. בתצורתו, המודל מורכב מתרבית משולשת הכוללת תאי אנדותל דמויי מוח (BLECs), פריסיטים ואסטרוציטים, שלושת השחקנים התאיים העיקריים של BBB הדרושים כדי לגרום ולווסת את תכונות ה-BBB באופן פיזיולוגי יותר ללא צורך בתרכובות מתהדקות. המודל שפותח בפורמט של 12 לוחות, מוכן לאחר 6 ימים של תרבית משולשת, מאופיין בתכונות פיזיקליות, ביטויי גנים וחלבונים ומשמש למדידת הובלת ננו-ג’ל פולימרי. המודל יכול לשמש למגוון רחב של ניסויים בתנאים בריאים ופתולוגיים ומייצג כלי רב ערך להערכות פרה-קליניות של הובלת מולקולות וחלקיקים, כמו גם לסחר בין-תאי ותוך-תאי.
ה-BBB, הממוקם ברמה של תאי אנדותל נימיים במוח (ECs), שולט ומווסת את הגישה לפרנכימה של המוח, שהיא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס במוח ועל תפקודם של תאים עצביים 1,2. עם זאת, במקרה של פתולוגיה במוח, חוסר גישה לפרנכימה המוח מייצג מכשול אמיתי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
ל-BBB ECs יש מערכת מורכבת של תכונות, כולל חלבוני צומת הדוקים (TJ), האוטמים את החלל הבין-תאי, הקשורים למערכת של משאבות efflux, טרנספורטרים ספציפיים וקולטנים, השולטים במסלול הטרנס-תאי 1,2,3. יתר על כן, כל התכונות הללו מושרות ומתוחזקות, הודות לתקשורת עם הפריסיטים המוטבעים בקרום המרתף BBB EC והאסטרוציטים, שרגליהם הסופיות מקיפות את נימי המוח 1,2,3. לפיכך, חקר ה-BBB במבחנה הוא אתגר בהתחשב במורכבות הארכיטקטורה שלו ובתקשורת בין סוגי התאים השונים המרכיבים את היחידה הנוירו-וסקולרית (NVU)2. יתר על כן, סוגי התאים השונים חיוניים לאינדוקציה ולתחזוקה של תכונות BBB וכתוצאה מכך משפיעים על חיזוי המעבר דרך ה- BBB. אסטרטגיות שונות להעברת תרופות למוח כבר נבדקו באמצעות פאנל גדול של טקטיקות כדי לעקוף את התכונות המוגבלות של BBB4. לאחרונה, עם התקדמות הננוטכנולוגיה, מפותחים חומרים חדשים ליישומים כנשאי תרופות 5,6. בנוסף לעומס הגבוה יותר שלהם, רעילות מופחתת וזמינות ביולוגית מוגברת של תרופות, ננו-חומרים חדשים אלה יכולים לתפקד עבור אסטרטגיית סוס טרויאני לחצות את ה-BBB ולתקוף באופן ספציפי תאים בפרנכימה 5,6. מבין הסוגים השונים של ננו-חומרים המוערכים, ננו-ג’לים משכו תשומת לב רבה, בעיקר בשל תכונותיהם הקולואידיות ויכולתם להתאים את המבנה הכימי כדי להציג תכונות מגיבות לגירויים 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
מודלים במבחנה מפותחים כיום למחקרים פרה-קליניים המשתמשים בתאים אנושיים כדי לחזות חדירה מוחית של תרופות16. קיימות הגדרות שונות של מודלים אלה, החל ממונו-שכבות של ECs במוח ועד למערכות תאים מרובות16. בהתחשב בחשיבותם של תאי NVU באינדוקציה ובתחזוקה של BBB ובתגובה המתואמת לסביבה הפתולוגית, מודלים של BBB במבחנה צריכים לשקול את כל הגיבורים האלה כדי לשפר את הרלוונטיות של החיזוי 2,17.
השיטה הנוכחית מתארת הקמת תרבית משולשת במבחנה של ה-BBB האנושי, אשר מפותח במלואו עם תאים אנושיים כדי לחקור מנגנונים מולקולריים תאיים ואנושיים ספציפיים. כדי להיות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, המודל מורכב משלושת השחקנים התאיים העיקריים של ה- BBB (ECs, פריציטים ואסטרוציטים) הדרושים כדי לגרום ולתחזק את תכונות ה- BBB, ללא שימוש בתרכובות הידוק והצגת סט של תכונות הנדרשות להיחשב כמודל BBB במבחנה 16,18. המודל מוגדר בתצורה התוחמת את תא הדם והמוח, ומתאים למחקרים פרה-קליניים של הובלת תרופות וחלקיקים כדי לחזות חדירה למוח. התועלת של המודל מודגמת על ידי מדידת ההובלה של ננו-ג’לים פולימריים.
הטיפול במחלות מוח נותר אתגר בהתחשב בקושי של התרופות לעבור את ה-BBB כדי להגיע ליעדים התאיים והמולקולריים שלהן בפרנכימה של המוח.
פיתוח תרופות למחלות מוח מציג כיום אחוזי הצלחה נמוכים מכיוון שרוב התרופות המציגות תוצאות מבטיחות במודלים פרה-קליניים לא הראו תועלת כלשהי כאשר נעשה בהן שימוש במרפאה. בעקבות “כלל 3R”, שמטרתו להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים לניסויים, מודלים חוץ גופיים של BBB מפותחים כדי לחקור פתולוגיות מוחיות ולחזות חדירה מוחית של תרופות29. מודלים חוץ-גופיים של BBB פותחו בעיקר באמצעות תאים של בעלי חיים והפכו מתוחכמים יותר כדי לשפר את הרלוונטיות של התוצאות שהושגו16. אחת ההתפתחויות המשמעותיות בשימוש בתאים אנושיים, המביאה תובנה חדשה שאין להכחישה, ברמה התאית והמולקולרית, לחקר מנגנוני מחלות אנושיים16. עם זאת, פיתוח מודלים רלוונטיים מחייב התחשבות בשיפור הגדרות המודלים של BBB במבחנה והידע הנובע, הודות למודלים של בעלי חיים. לפיכך, עליו לקחת בחשבון את המורכבות של ארכיטקטורת ה-BBB ואת החשיבות של תקשורת התא-תא כדי לחקור את ה-BBB בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים30.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה להקמת מודל BBB במבחנה אנושי מלא הכולל את שלושת סוגי התאים העיקריים של ה-BBB, ללא הגבלה של גישה לרקמת המוח. כמערכת מרובת תאים, האינדוקציה והתחזוקה של תכונות BBB, ללא שימוש מלאכותי בתרכובות מתהדקות, אלא המושרות על ידי תקשורת בין תאים, רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית ותואמת את אינדוקציה in vivo של תכונות BBB31. לפיכך, כיבוד הכרונולוגיה של הפרוטוקול הוא בעל חשיבות עליונה להצלחת הפרוטוקול. יתר על כן, זמני הדגירה במהלך הגדרת התרבית המשולשת ולאחר הרכבת שלושת סוגי התאים מייצגים את השלבים הקריטיים העיקריים של הפרוטוקול.
תכונות ה- BBB ב- ECs מושרות על ידי התרבות המשותפת עם פריציטים, כפי שתואר עבור מודל התרבות המשותפת24. לפיכך, תרבות הפריסיטים בצד האחורי של מסנן ההוספה היא הנקודה הקריטית ביותר ומחייבת הקפדה על הפרוטוקול בסיכון שלא יהיו מספיק פריסיטים להשראת תכונות ה- BBB. קודם כל, במהלך הליך הציפוי וגם זריעת תאים, יש לשים לב לא לקבל את הכיסוי של צלחת פטרי במגע עם הציפוי וגם את המדיום ברגע שהתאים נזרעו כדי להבטיח ציפוי טוב של המסנן ולא לאבד תאים (שלבים 2.2.1 ו 2.2.4). יתר על כן, לאחר פריציטים הם זרעו, חיוני לחכות את הזמן המצוין עבור ההתקשרות של pericytes (שלב 2.2.4) לפני החזרת מסנן להוסיף עבור ציפוי וזריעה של ECs בצד השני (שלבים 2.2.5 ו 2.3). לאחר הזריעה, נדרשים שישה ימים כדי להשרות את תכונות ה-BBB באמצעות תקשורת בין תאים (שלב 2.4).
המודל מאומת במונחים של חדירות מוגבלת (הקשורה לקביעת הצמתים ההדוקים) שכן ה- ECs של מודל התרבית המשולשת מציגים ערכי חדירות לסמני שלמות BBB הדומים למודל התרבות המשותפת המאומת ונמדדים גם במודלים מאומתים של בעלי חיים או בני אדם 16,27,32. יתר על כן, אימות של מודל BBB במבחנה דורש, בנוסף לחדירות המוגבלת, את ההיענות לסוגי תאים אחרים של NVU ואת הביטוי של קולטנים פונקציונליים ומובילים16. בנוסף, המודל ניתן לשחזור ומייצר מספר מסנני הכנסה ובארות לביצוע ניתוחים רבים (ביטוי גנים וחלבונים, צביעה פלואורסצנטית, בדיקות רעילות) על כל סוג תא בנפרד ללא צורך בשיטת מיון תאים.
המודל פותח באמצעות מסנן בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר כדי שיהיה סוג תא אחד בכל צד של מסנן ההוספה. מערכת סינון ההחדרה אפשרה לחקור תקשורת בין תאים בתנאים פיזיולוגיים על ידי העברתה על אסטרוציטים המכילים היטב. נוכחות האסטרוציטים במערכת מייצגת ערך פלוס בהשוואה לתרבית המשותפת הראשונית במבחנה מודל24. ואכן, בהתחשב בחשיבותם של אסטרוציטים בפיזיולוגיה של ה-BBB, סוג תא שלישי זה מאפשר הבנה נוספת של תקשורת התא-תא בתוך ה-BBB. יתר על כן, מערכת תרבית התאים המשולשת יכולה להיחקר גם בתנאים פתולוגיים כגון שבץ, שבו האסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני33,34,35. בנוסף, ניתן למקם בקלות את התכנון של BLECs/ pericytes משני צידי מסנן ההחדרה על סוגי תאים אחרים כדי לחקות מצבים פתולוגיים כגון סרטן המוח23.
גודל הנקבוביות של מסנן ההוספה יכול להביא למגבלות בניסויים מסוימים, כגון העברת תאים על פני ה- BBB. עם זאת, פיתוח המודל עם גודל נקבוביות גדול יותר דורש התאמה של הפרוטוקול כדי להבטיח היווצרות של מונולאייר פיזיולוגי של ECs ולא שכבות מרובות, אשר אינו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כדי לחקות את BBB36.
תחולת המודל הוכחה באמצעות ניסוי תובלה של NGs המציג את האפשרות לבצע ניסוי הובלה באמצעות מערכת רב-תאית. עם זאת, יש להיות מודעים לקשיים בקיום תרכובת בקרה או מולקולה לניסוי ההובלה, החולקת תכונות דומות עם NGs מכיוון שכל ננו-מבנה מציג סט תכונות ייחודי (משקל מולקולרי, מטען, צורה, תכונות פיזיקליות, היווצרות חלבון קורונה).
מגבלה אחת של המודל היא היעדר לחץ גזירה, שהוכח כמשפיע על ההתמיינות של ECs ועל הביטוי של חלבוני TJ37. עם זאת, פיתוח מערכת נוזלית המחקה את נימי המוח הוא מאתגר בהתחשב במורכבות של הוספת חלק נוזלי, הדורש מכשיר מסוים, במערכת מרובת תאים. יתר על כן, המכשיר המסוים בדרך כלל אינו זמין מסחרית ואינו מאפשר שכפולים רבים, ובכך הופך את המערכות הנוזליות לפחות מותאמות לשימוש בתפוקה גבוהה.
לסיכום, מערכת התרבית המשולשת הזו המורכבת מתאים אנושיים משחזרת במבחנה את הארכיטקטורה של ה- BBB. זה מאפשר יצירת תוספות רבות שניתן להשתמש בהן לסינון נרחב של תרכובות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מוענקת על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענקים No 764958, כחלק מפרויקט NANOSTEM, רשת הכשרה חדשנית של מארי סקלודובסקה-קירי (ITN) (מלגת אלאונורה ריצי). מחקר זה מוענק על ידי “Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais” (מלגה לקלמנס דליגן), “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’teencent” (SFCE), האגודה “l’étoile de Martin” והאגודה “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |