Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Sebbene l’uracile sia una base normale nell’RNA, è una lesione comune e altamente mutagena nel DNA genomico. L’uracile può derivare dalla deaminazione idrolitica spontanea/enzimatica di una deossicitidina. In ogni cellula vivente, questa deaminazione avviene 100-500 volte al giorno in condizioni ^{fisiologiche1,2}. Se queste alterazioni non vengono riparate, ci può essere un cambiamento nella composizione della sequenza del DNA, causando mutazioni. Poiché l’uracile nel DNA preferisce accoppiarsi con dATP durante la replicazione, se la citosina si deamina in uracile, in due eventi di replicazione, ci sarà una nuova mutazione di transizione da G:C ad A:T in metà del DNA della progenie3.

Tra le strategie cellulari per mantenere la stabilità genetica, la riparazione dell’escissione di base (BER) è un meccanismo essenziale che ripara le basi danneggiate, come l’uracile, nel ^DNA4. BER è un processo altamente conservato evolutivamente. Esistono due vie BER generali: la via a patch corta che porta a un tratto di riparazione di un singolo nucleotide e la via a patch lunga che produce un tratto di riparazione di almeno due nucleotidi5. BER è un meccanismo coordinato che si verifica in più passaggi. Il primo passo nel BER è l’idrolisi enzimatica della base nucleotidica danneggiata da una glicosilasi del DNA specifica per il danno per generare un sito intermedio apurinico/aprimidinico (AP)⁶. Questo è seguito dalla scissione della spina dorsale zucchero-fosfato nel sito AP da un’endonucleasi, pulizia delle estremità del DNA da una liasi, riempimento del gap da una DNA polimerasi e sigillatura del nick finale da una ^ligasi5.

Uracil-DNA glycosylase (UDG) idrolizza l’uracile dal DNA contenente uracile per BER in Escherichia coli. I saggi UDG convenzionali che utilizzano DNA radiomarcato che coinvolgono diverse tecniche di separazione6,7,8,9,10,11,12,13 sono di solito dispendiosi in termini di tempo, laboriosità, con costosi reagenti di etichettatura, procedure complicate e che richiedono una formazione e una pratica intensive per ridurre i rischi di esposizione a materiali radioattivi. I saggi oligonucleotidici fluorometrici sono stati sviluppati in sostituzione dell’etichettatura dei radioisotopi14, oltre ai beacon molecolari e alla tecnologia di trasferimento dell’energia di risonanza di Förster15,16,17,18,19,20. Tuttavia, è richiesta un’etichettatura specifica per tutti i metodi di cui sopra. Recentemente sono stati sviluppati saggi di biosensori privi di ^{etichette21,22,23} e metodi colorimetrici basati sulla formazione di un G-quadruplex24,25,26. Tuttavia, più coppie A:U o sequenze appositamente progettate nelle sonde complicano la definizione dell’unità enzimatica.

MALDI-TOF MS è una tecnologia che potrebbe essere di grande utilità nell’analisi del DNA. Le applicazioni sviluppate includono la genotipizzazione del polimorfismo a singolo ^{nucleotide27,28}, l’analisi nucleotidica ^modificata29 e l’identificazione intermedia di riparazione del ^{DNA30,31,32,33,34}. MALDI-TOF MS deve essere prontamente adottato per l’analisi della glicosilasi del DNA per rilevare prodotti a DNA contenenti sito AP. Tuttavia, i siti AP nel DNA sono soggetti a rottura del filamento in molte condizioni ^{sperimentali33}. Un test UDG viene presentato qui utilizzando MALDI-TOF MS per misurare direttamente la produzione del sito AP senza un significativo rumore di strand-break. Questo metodo senza etichette è facile da usare e ha un alto potenziale per l’applicazione farmaceutica dello screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.