To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse

Rod fotoreseptorceller, tett pakket i det ytterste laget av nevral netthinnen, er en integrert del av svakt lyssyn. For å fungere som trofaste fotontellere, bruker stenger en G-proteinbasert signalvei, kalt fototransduksjon, for å generere raske, forsterkede og reproduserbare responser på enkelt fotonfangst. Denne responsen på lys utløser til slutt en endring i strømmen ved plasmamembranen og signaliseres deretter til resten av det visuelle ^systemet1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en distinkt stanglignende form og viser en svært polarisert cellulær morfologi, bestående av et ytre segment (OS), indre segment (IS), cellekropp (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulære rom har spesifikke proteinmaskiner (membranbundet og løselig), biomolekylære egenskaper og proteinkomplekser som spiller avgjørende roller som visuell fototransduksjon, generell rengjøring og proteinsyntese og synaptisk ^{overføring2,3}.

For over 30 år siden ble den lysavhengige gjensidige bevegelsen av subcellulære proteiner, spesielt transducin (vekk fra operativsystemet) og arrestin (mot operativsystemet), først observert4,5,6,7. Tidlig ble dette observerte fenomenet mottatt med skepsis, delvis på grunn av immunhiistokjemiens sårbarhet for epitopmaskering8. Tidlig på 2000-tallet ble stimulusavhengig proteintranslokasjon bekreftet ved hjelp av en streng og krevende fysisk seksjoneringsteknikk9. Seriell tangensiell seksjonering av den frosne flatmonterte gnager netthinnen etterfulgt av immunoblotting avslørte at transducin9,10, ^{arrestin11,12}, og ^recoverin13 alle gjennomgår subcellulær omfordeling som svar på lys. Det antas at lysdrevet translokasjon av disse viktige signalproteinene ikke bare regulerer følsomheten til fototransduksjonskaskaden9,14,15, men kan også være nevrobeskyttende mot lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stenger ser ut til å ha stor betydning for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker som tillater isolering av forskjellige subcellulære rom for å bestemme proteinfordeling verdifulle forskningsverktøy.

For tiden er det noen få metoder som tar sikte på å isolere stangens subcellulære rom. Imidlertid kan disse metodene være lange og vanskelige å reprodusere, eller krever en betydelig mengde retinal isolering. Rod ytre segment (ROS) preparater via tetthet gradient sentrifugering19, for eksempel, brukes ofte til å skille ROS fra retinal homogenat. Denne metoden er mye brukt for vestlig blot, men prosedyren er svært tidkrevende og krever minst 8-12 murine ^netthinne20. På den annen side har seriell tangentiell seksjonering av frossen murine og rotte netthinne blitt implementert for å isolere operativsystemet, IS, CB og ST9,11,13. Denne metoden er imidlertid teknisk utfordrende på grunn av nødvendigheten av å fullt ut flate ut den lille og svært buede murine netthinnen for å justere netthinnelagene før tangentiell seksjonering. Siden det er en mengde musemodeller og transgene mus som recapitulerer sykdommer i det visuelle systemet, holder opprettelsen av en teknikk som pålitelig, raskt og enkelt skiller individuelle stangrom løfter om å avsløre de fysiologiske prosessene som oppstår i hvert spesialiserte rom og mekanismene som ligger til grunn for visuelle prosesser i helse og sykdom.

For å lette disse undersøkelsene beskriver vi to peelingmetoder som isolerer stang subcellulære rom lettere enn dagens protokoller. Den første peelingmetoden, tilpasset fra en teknikk for å eksponere fluorescerende merkede bipolare celler for patchklemmeopptak21, bruker cellulosefilterpapir for sekvensielt å fjerne ROS fra en levende, isolert murine netthinne (figur 1). Den andre metoden, tilpasset fra en prosedyre som isolerer de tre primære netthinnecellelagene fra en ^kylling22 og ^frog23 netthinne, bruker tape for å fjerne ROS og stang indre segment (RIS) fra en lyofilisert netthinne (figur 2). Begge prosedyrene kan fullføres i 1 time og er betydelig brukervennlige. Vi gir validering av effektiviteten til disse to separasjonsprotokollene for vestlig blotte ved å bruke mørktilpasset og lys eksponert netthinne fra C57BL/6J-mus for å demonstrere lysindusert translokasjon av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Videre, ved hjelp av tape peeling-metoden, gir vi ytterligere bevis på at teknikken vår kan brukes til å undersøke og adressere inkonsekvenser mellom proteinlokaliseringsdata som er samlet inn av immunocytokjemi (ICC) og vestlige flekker. Spesielt viste vår teknikk at: 1) protein kinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke bare i bipolare celler, men også i murine ROS og RIS, om enn i lave ^{konsentrasjoner24,25}, og 2) rhodopsin kinase (GRK1) er for tiden hovedsakelig i den isolerte OS-prøven. Disse dataene viser effektiviteten av våre to peeling teknikker for separering og kvantifisering av spesifikke stang og retinal proteiner.