Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Las células fotorreceptoras de varilla, estrechamente empaquetadas en la capa más externa de la retina neural, son una parte integral de la visión con luz tenue. Para funcionar como contadores de fotones fieles, las varillas utilizan una vía de señalización basada en proteína G, denominada fototransducción, para generar respuestas rápidas, amplificadas y reproducibles a la captura de un solo fotón. Esta respuesta a la luz finalmente desencadena un cambio en la corriente en la membrana plasmática y posteriormente se señala al resto del sistema ^visual1. Como su nombre lo indica, cada célula de varilla tiene una forma distinta en forma de varilla y exhibe una morfología celular altamente polarizada, que consiste en un segmento externo (OS), segmento interno (IS), cuerpo celular (CB) y terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular tiene una maquinaria proteica específica (unida a la membrana y soluble), características biomoleculares y complejos de proteínas que desempeñan funciones cruciales como la fototransducción visual, la limpieza general y la síntesis de proteínas, y la transmisión sináptica2,3.

Hace más de 30 años, se observó por primera vez el movimiento recíproco dependiente de la luz de las proteínas subcelulares, específicamente la transducina (lejos del SO) y la arrestina (hacia la SG^)4,5,6,7. Al principio, este fenómeno observado fue recibido con escepticismo, debido en parte a la vulnerabilidad de la inmunohistoquímica al enmascaramiento del epítopo8. A principios de la década de 2000, se confirmó la translocación de proteínas dependientes de estímulos mediante el uso de una rigurosa y ardua técnica de seccionamiento ^físico9. La seccionamiento tangencial serial de las retinas de roedores de montaje plano congelado seguido de inmunoblotting reveló que la ^{transducina9,10}, la ^{arrestina11,12} y la ^{recuperación13} experimentan redistribución subcelular en respuesta a la luz. Se cree que la translocación impulsada por la luz de estas proteínas clave de señalización no solo regula la sensibilidad de la cascada de fototransducción9,14,15, sino que también puede ser neuroprotectora contra el daño de la luz16,17,18. Debido a que el transporte de proteínas impulsado por la luz en bastones parece ser muy significativo para la biología y fisiología celular de los bastones, las técnicas que permiten el aislamiento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar la distribución de proteínas son herramientas de investigación valiosas.

Actualmente, hay algunos métodos destinados a aislar los compartimentos subcelulares de los bastones. Sin embargo, estos métodos pueden ser largos y difíciles de reproducir, o requieren una cantidad considerable de aislamiento de retina. Las preparaciones de segmentos externos de varilla (ROS) a través de la centrifugación por gradiente de ^densidad19, por ejemplo, se usan comúnmente para separar las ROS del homogeneizado retiniano. Este método es ampliamente utilizado para western blot, pero el procedimiento lleva mucho tiempo y requiere un mínimo de 8-12 retinas ^murinas20. Por otro lado, la seccionamiento tangencial serial de retinas murinas y de rata congeladas se ha implementado con éxito en el aislamiento de la SG, IS, CB y ST9,11,13. Sin embargo, este método es técnicamente desafiante debido a la necesidad de aplanar completamente la retina murina pequeña y altamente curvada para alinear las capas retinianas antes de la sección tangencial. Dado que hay una gran cantidad de modelos de ratones y ratones transgénicos que recapitulan enfermedades del sistema visual, la creación de una técnica que separe de manera confiable, rápida y fácil los compartimentos de varillas individuales es prometedora para revelar los procesos fisiológicos que ocurren en cada compartimento especializado y los mecanismos que subyacen a los procesos visuales en la salud y la enfermedad.

Para facilitar estas investigaciones, describimos dos métodos de peeling que aíslan los compartimentos subcelulares de los bastones más fácilmente que los protocolos actuales. El primer método de peeling, adaptado de una técnica para exponer células bipolares marcadas fluorescentemente para el registro de pinzas de ^parche21, emplea papel de filtro de celulosa para eliminar secuencialmente las ROS de una retina murina viva y aislada (Figura 1). El segundo método, adaptado de un procedimiento que aísla las tres capas primarias de células retinianas de una retina de ^{pollito22 y rana23}, utiliza cinta adhesiva para eliminar el ROS y el segmento interno del bastón (RIS) de una retina liofilizada (Figura 2). Ambos procedimientos se pueden completar en 1 h y son considerablemente fáciles de usar. Proporcionamos validación de la efectividad de estos dos protocolos de separación para western blot mediante la utilización de retinas adaptadas a la oscuridad y expuestas a la luz de ratones C57BL / 6J para demostrar la translocación inducida por la luz de la transducina de bastón (GNAT1) y la arrestina (ARR1). Además, utilizando el método de pelado en cinta, proporcionamos evidencia adicional de que nuestra técnica se puede utilizar para examinar y abordar las inconsistencias entre los datos de localización de proteínas adquiridos por inmunocitoquímica (ICC) y western blots. Específicamente, nuestra técnica mostró que: 1) la isoforma de la proteína quinasa C-alfa (PKCα) está presente no solo en células bipolares, sino también en ROS murinas y RIS, aunque en bajas ^{concentraciones24,25}, y 2) rodopsina quinasa (GRK1) está presente predominantemente en la muestra aislada de SG. Estos datos demuestran la efectividad de nuestras dos técnicas de peeling para separar y cuantificar proteínas específicas de bastones y retinales.