タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

神経網膜の最外層にしっかりと詰め込まれた桿体視細胞は、薄暗い光の視覚の不可欠な部分です。忠実な光子カウンターとして機能するために、ロッドは、光変換と呼ばれるGタンパク質ベースのシグナル伝達経路を利用して、単一光子捕捉に対する迅速で増幅された再現可能な応答を生成する。光に対するこの応答は、最終的に原形質膜における電流の変化を引き起こし、その後、視覚系の残りの部分に信号を送る¹。その名前が示すように、各桿体細胞は明確な棒状の形状を有し、外側セグメント(OS)、内側セグメント(IS)、細胞体(CB)、およびシナプス末端(ST)からなる高度に分極した細胞形態を示す。各細胞下区画には、特定のタンパク質機構(膜結合および可溶性)、生体分子的特徴、および視覚的光伝達、一般的なハウスキーピングおよびタンパク質合成、シナプス伝達などの重要な役割を果たすタンパク質複合体があります^2,3。

30年以上前、細胞内タンパク質、特にトランスデューシン(OSから離れる)とアレスチン(OSに向かう)の光依存的な相互運動が最初に観察されました^4,5,6,7。早い段階で、この観察された現象は、エピトープマスキングに対する免疫組織化学の脆弱性のために、懐疑的に受け止められました⁸。2000年代初頭、刺激依存性のタンパク質転座は、厳格で困難な物理的切片技術を用いて確認された⁹。凍結したフラットマウントげっ歯類網膜の連続接線切片化とそれに続くイムノブロッティングにより、トランスデューシン^9、10、アレステイン^11、12、および^recoverin13はすべて、光に応答して細胞内再分布を受けることが明らかになった。これらの重要なシグナル伝達タンパク質の光駆動転座は、光変換カスケードの感受性を調節するだけでなく9,14,15だけでなく、光損傷に対する神経保護も可能であると考えられている^16,17,18。桿体における光駆動タンパク質輸送は、桿体細胞の生物学および生理学にとって非常に重要であるように思われるので、タンパク質分布を決定するために異なる細胞内区画の単離を可能にする技術は貴重な研究ツールである。

現在、桿体細胞下区画を単離することを目的としたいくつかの方法がある。しかしながら、これらの方法は、長くて再現が困難であり得るか、またはかなりの量の網膜分離物を必要とする。ロッドアウターセグメント(ROS)調製物は、密度勾配遠心分離¹⁹を介して、例えば、網膜ホモジネートからROSを分離するために一般的に使用される。この方法はウェスタンブロットに広く使用されているが、この手順は非常に時間がかかり、最低8〜12匹のマウス網膜²⁰を必要とする。一方、凍結マウスおよびラット網膜の直列接線切片化は、OS、IS、CB、および^ST9、¹¹、¹³を単離する際に首尾よく実施されている。しかし、この方法は、接線切除の前に網膜層を整列させるために、小さくて高度に湾曲したマウス網膜を完全に平坦化する必要があるため、技術的に困難である。視覚系の疾患を再現するマウスモデルやトランスジェニックマウスは数多く存在するため、個々の桿体コンパートメントを確実に、迅速に、そして容易に分離する技術の創出は、各特殊なコンパートメントで起こる生理学的プロセスと、健康および疾患における視覚プロセスの根底にあるメカニズムを明らかにする上で有望である。

これらの調査を容易にするために、我々は、現在のプロトコルよりも容易に桿体細胞下区画を分離する2つの剥離方法を説明する。第1の剥離方法は、パッチクランプ記録²¹のために蛍光標識されたバイポーラ細胞を露出させる技術から適合し、セルロース濾紙を使用して、生きた単離されたマウス網膜からROSを順次除去する(図1)。第2の方法は、chick22および^frog23網膜から³つの一次網膜細胞層を単離する手順から適合し、粘着テープを使用して凍結乾燥網膜からROSおよび桿体内部セグメント(RIS)を除去する(図2)。どちらの手順も1時間で完了でき、かなりユーザーフレンドリーです。我々は、C57BL/6Jマウスからの暗適応および光曝露網膜を利用して、ロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の光誘発転座を実証することによって、ウェスタンブロットに対するこれら2つの分離プロトコルの有効性の検証を提供する。さらに、テープ剥離法を用いて、我々の技術が免疫細胞化学(ICC)によって取得されたタンパク質局在データとウェスタンブロットとの間の不整合を調べ、対処するために使用することができるという追加の証拠を提供する。具体的には、我々の技術は、1)プロテインキナーゼC-α(PKCα)アイソフォームが双極性細胞だけでなく、マウスROSおよびRISにも低濃度ではあるが^24,25存在し、2)ロドプシンキナーゼ(GRK1)が単離されたOSサンプル中に主に存在することを示した。これらのデータは、特定のロッドタンパク質とレチナールタンパク質を分離および定量するための2つの剥離技術の有効性を示しています。