Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Stäbchen-Photorezeptorzellen, dicht gepackt in der äußersten Schicht der neuronalen Netzhaut, sind ein integraler Bestandteil des Dimmlichts. Um als treue Photonenzähler zu fungieren, verwenden Stäbchen einen G-Protein-basierten Signalweg, der als Phototransduktion bezeichnet wird, um schnelle, verstärkte und reproduzierbare Reaktionen auf den Einfang einzelner Photonen zu erzeugen. Diese Reaktion auf Licht löst letztendlich eine Änderung des Stroms an der Plasmamembran aus und wird anschließend dem Rest des visuellen Systems ^{signalisiert1.} Wie der Name schon sagt, hat jede Stäbchenzelle eine ausgeprägte stäbchenartige Form und weist eine stark polarisierte zelluläre Morphologie auf, die aus einem äußeren Segment (OS), einem inneren Segment (IS), einem Zellkörper (CB) und einem synaptischen Terminal (ST) besteht. Jedes subzelluläre Kompartiment hat spezifische Proteinmaschinen (membrangebunden und löslich), biomolekulare Merkmale und Proteinkomplexe, die eine entscheidende Rolle spielen, wie visuelle Phototransduktion, allgemeine Haushaltsführung und Proteinsynthese sowie synaptische ^{Übertragung2,3}.

Vor über 30 Jahren wurde erstmals die lichtabhängige reziproke Bewegung subzellulärer Proteine, insbesondere Transducin (weg vom OS) und Arrestin (in Richtung OS), beobachtet4,5,6,7. Schon früh wurde dieses beobachtete Phänomen mit Skepsis aufgenommen, was zum Teil auf die Anfälligkeit der Immunhistochemie für die Epitopmaskierung zurückzuführen ^ist8. In den frühen 2000er Jahren wurde die stimulusabhängige Proteintranslokation durch die Verwendung einer rigorosen und mühsamen physikalischen Schnitttechnik ^bestätigt9. Serielle tangentiale Abschnitte der gefrorenen flach montierten Nagetiernetzhaut, gefolgt von Immunoblotting, zeigten, dass Transducin9,10, Arrestin11,12 und ^Recoverin13 alle eine subzelluläre Umverteilung als Reaktion auf Licht erfahren. Es wird angenommen, dass die lichtgetriebene Translokation dieser wichtigen Signalproteine nicht nur die Empfindlichkeit der Phototransduktionskaskade reguliert9,14,15, sondern auch neuroprotektiv gegen Lichtschäden16,17,18 sein kann. Da der lichtgetriebene Proteintransport in Stäbchen für die Biologie und Physiologie der Stäbchenzellen von großer Bedeutung zu sein scheint, sind Techniken, die die Isolierung verschiedener subzellulärer Kompartimente zur Bestimmung der Proteinverteilung ermöglichen, wertvolle Forschungsinstrumente.

Derzeit gibt es einige Methoden, die darauf abzielen, die subzellulären Kompartimente des Stäbchens zu isolieren. Diese Methoden können jedoch langwierig und schwer zu reproduzieren sein oder eine beträchtliche Menge an Netzhautisolat erfordern. ROS-Präparate (Rod Outer Segment) über Dichtegradientenzentrifugation19 werden beispielsweise häufig verwendet, um das ROS vom retinalen Homogenat zu trennen^. Diese Methode wird häufig für Western Blot verwendet, aber das Verfahren ist sehr zeitaufwendig und erfordert mindestens 8-12 murine ^Retinae20. Auf der anderen Seite wurde die serielle tangentiale Schnittführung von gefrorenen murinen und Rattennetzhaut erfolgreich bei der Isolierung von OS, IS, CB und ST9,11,13 implementiert. Diese Methode ist jedoch technisch anspruchsvoll, da die kleine und stark gekrümmte murine Netzhaut vollständig abgeflacht werden muss, um die Netzhautschichten vor dem tangentialen Schnitt auszurichten. Da es eine Fülle von Mausmodellen und transgenen Mäusen gibt, die Krankheiten des visuellen Systems rekapitulieren, ist die Schaffung einer Technik, die zuverlässig, schnell und einfach einzelne Stäbchenkompartimente trennt, vielversprechend, um die physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment auftreten, und die Mechanismen, die visuellen Prozessen in Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.

Um diese Untersuchungen zu erleichtern, beschreiben wir zwei Peeling-Methoden, die subzelluläre Kompartimente von Stäbchen leichter isolieren als aktuelle Protokolle. Die erste Peeling-Methode, die von einer Technik zur Freilegung fluoreszierend markierter bipolarer Zellen für die Aufzeichnung von Patch-Clampen21 angepasst wurde^, verwendet Zellulosefilterpapier, um das ROS nacheinander aus einer lebenden, isolierten murinen Netzhaut zu entfernen (Abbildung 1). Die zweite Methode, angepasst an ein Verfahren, das die drei primären retinalen Zellschichten von einer Chick22- und ^{frog23-Netzhaut isoliert,} verwendet Klebeband, um das ROS^– und Stäbcheninnensegment (RIS) von einer lyophilisierten Netzhaut zu entfernen (Abbildung 2). Beide Verfahren können in 1 h abgeschlossen werden und sind erheblich benutzerfreundlich. Wir bieten eine Validierung der Wirksamkeit dieser beiden Trennprotokolle für Western Blot, indem wir dunkel angepasste und lichtexponierte Netzhaut von C57BL/6J-Mäusen verwenden, um die lichtinduzierte Translokation von Stäbchentransducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1) zu demonstrieren. Darüber hinaus liefern wir mit der Tape-Peeling-Methode zusätzliche Beweise dafür, dass unsere Technik verwendet werden kann, um Inkonsistenzen zwischen Proteinlokalisierungsdaten, die durch Immunzytochemie (ICC) und westliche Blots gewonnen wurden, zu untersuchen und zu beheben. Insbesondere zeigte unsere Technik, dass: 1) die Proteinkinase C-alpha (PKCα) Isoform nicht nur in bipolaren Zellen, sondern auch in murinem ROS und RIS vorhanden ist, wenn auch in niedrigen ^{Konzentrationen24,25,} und 2) Rhodopsinkinase (GRK1) ist überwiegend in der isolierten OS-Probe vorhanden. Diese Daten zeigen die Wirksamkeit unserer beiden Peeling-Techniken zur Trennung und Quantifizierung spezifischer Stäbchen- und Netzhautproteine.