To peelingmetoder til isolering af fotoreceptorcellerum i musenehinden til proteinanalyse

Rodfotoreceptorceller, tæt pakket i det yderste lag af den neurale nethinde, er en integreret del af svagt lyssyn. For at fungere som trofaste fotontællere bruger stænger en G-proteinbaseret signalvej, nævnt fototransduktion, til at generere hurtige, forstærkede og reproducerbare reaktioner på enkelt fotonoptagelse. Denne reaktion på lys udløser i sidste ende en ændring i strømmen ved plasmamembranen og signaleres efterfølgende til resten af det visuelle ^system1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en særskilt stanglignende form og udviser en stærkt polariseret cellulær morfologi, der består af et ydre segment (OS), indre segment (IS), cellelegeme (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulært rum har specifikke proteinmaskiner (membranbundne og opløselige), biomolekylære egenskaber og proteinkomplekser, der spiller afgørende roller såsom visuel fototransduktion, generel husholdning og proteinsyntese og synaptisk ^{transmission2,3}.

For over 30 år siden blev den lysafhængige gensidige bevægelse af subcellulære proteiner, specifikt transducin (væk fra operativsystemet) og arrestin (mod operativsystemet), først observeret4,5,6,7. Tidligt blev dette observerede fænomen modtaget med skepsis, delvis på grund af immunhistokemiens sårbarhed over for epitopmaskering8. I begyndelsen af 2000’erne blev stimulusafhængig proteintranslokation bekræftet ved hjælp af en streng og besværlig fysisk sektioneringsteknik9. Seriel tangentiel sektionering af den frosne fladmonterede gnaver nethinde efterfulgt af immunoblotting afslørede, at transducin9,10, ^{arrestin11,12} og ^recoverin13 alle gennemgår subcellulær omfordeling som reaktion på lys. Det antages, at lysdrevet translokation af disse vigtige signalproteiner ikke kun regulerer følsomheden af fototransduktionskaskaden9,14,15, men kan også være neurobeskyttende mod lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stænger synes at være meget vigtig for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker, der tillader isolering af forskellige subcellulære rum til bestemmelse af proteinfordeling, værdifulde forskningsværktøjer.

I øjeblikket er der et par metoder, der tager sigte på at isolere stangens subcellulære rum. Disse metoder kan dog være langvarige og vanskelige at reproducere eller kræve en betydelig mængde retinal isolat. Stangens ydre segment (ROS) præparater via densitetsgradientcentrifugering19 anvendes for eksempel almindeligvis til at adskille ROS fra retinal homogenat. Denne metode anvendes i vid udstrækning til western blot, men proceduren er meget tidskrævende og kræver mindst 8-12 murine ^retinae20. På den anden side er seriel tangentiel sektionering af frossen murine og rotte nethinde blevet implementeret med succes i isolering af OS, IS, CB og ST9,11,13. Denne metode er imidlertid teknisk udfordrende på grund af nødvendigheden af fuldt ud at flade den lille og stærkt buede murin nethinde for at justere retinale lag inden tangentiel sektionering. Da der er en overflod af musemodeller og transgene mus, der rekapitulerer sygdomme i det visuelle system, er oprettelsen af en teknik, der pålideligt, hurtigt og let adskiller individuelle stangrum, lovende med at afsløre de fysiologiske processer, der forekommer i hvert specialiseret rum og de mekanismer, der ligger til grund for visuelle processer inden for sundhed og sygdom.

For at lette disse undersøgelser beskriver vi to skrælningsmetoder, der lettere isolerer stangens subcellulære rum end de nuværende protokoller. Den første peelingmetode, der er tilpasset fra en teknik til at udsætte fluorescerende mærkede bipolære celler til optagelse af ^{plasterklemmer21}, anvender cellulosefilterpapir til sekventielt at fjerne ROS fra en levende, isoleret murin nethinde (figur 1). Den anden metode, tilpasset fra en procedure, der isolerer de tre primære retinale cellelag fra en ^chick22 og ^frog23 nethinden, bruger klæbebånd til at fjerne ROS og stangens indre segment (RIS) fra en lyofiliseret nethinden (figur 2). Begge procedurer kan gennemføres på 1 time og er betydeligt brugervenlige. Vi leverer validering af effektiviteten af disse to separationsprotokoller for western blot ved at anvende mørketilpasset og lyseponeret nethinde fra C57BL/6J-mus til at demonstrere lysinduceret translokation af stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Desuden giver vi ved hjælp af båndskrælningsmetoden yderligere bevis for, at vores teknik kan bruges til at undersøge og adressere uoverensstemmelser mellem proteinlokaliseringsdata erhvervet af immunocytokemi (ICC) og vestlige blots. Specifikt viste vores teknik, at: 1) proteinkinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke kun i bipolære celler, men også i murin ROS og RIS, omend i lave ^{koncentrationer24,25}, og 2) rhodopsinkinase (GRK1) er overvejende til stede i den isolerede OS-prøve. Disse data viser effektiviteten af vores to peelingteknikker til adskillelse og kvantificering af specifikke stang- og retinale proteiner.