طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين
Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.
Abstract
المستقبلات الضوئية رود هي خلايا عصبية حسية عالية الاستقطاب مع مقصورات متميزة. قضبان الماوس طويلة (~ 80 ميكرومتر) ورقيقة (~ 2 ميكرومتر) ويتم تعبئتها أفقيا في الطبقة الخارجية من شبكية العين ، طبقة المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي إلى محاذاة المقصورات تحت الخلوية المماثلة. تقليديا ، تم استخدام التقسيم العرضي للشبكية المسطحة المجمدة لدراسة حركة وتوطين البروتينات داخل مقصورات قضيب مختلفة. ومع ذلك ، فإن الانحناء العالي لشبكية العين الفأر المهيمنة على القضيب يجعل التقسيم العرضي أمرا صعبا. بدافع من دراسة انتقال البروتين بين المقصورات ، قمنا بتطوير طريقتين للتقشير تعزلان بشكل موثوق الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والمقصورات تحت الخلوية الأخرى للبقع الغربية. توفر تقنياتنا السريعة والبسيطة نسبيا كسور غنية ومحددة تحت الخلايا لقياس توزيع وإعادة توزيع بروتينات المستقبلات الضوئية المهمة في القضبان العادية كميا. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تكييف تقنيات العزل هذه بسهولة لعزل تكوين البروتين للطبقات الخلوية الأخرى والتحقيق فيه كميا داخل كل من شبكية العين السليمة والمتدهورة.
Introduction
تعد خلايا المستقبلات الضوئية القضيبية ، المعبأة بإحكام في الطبقة الخارجية من شبكية العين العصبية ، جزءا لا يتجزأ من رؤية الضوء الخافت. للعمل كعدادات فوتون مخلصة ، تستخدم القضبان مسار إشارات قائم على بروتين G ، يسمى النقل الضوئي ، لتوليد استجابات سريعة وتضخيمية وقابلة للتكرار لالتقاط فوتون واحد. تؤدي هذه الاستجابة للضوء في النهاية إلى حدوث تغيير في التيار في غشاء البلازما ويتم الإشارة إليها لاحقا إلى بقية النظام البصري1. كما يوحي اسمها ، فإن كل خلية قضيب لها شكل مميز يشبه القضيب وتظهر مورفولوجيا خلوية شديدة الاستقطاب ، تتكون من جزء خارجي (OS) ، وجزء داخلي (IS) ، وجسم خلية (CB) ، ومحطة متشابكة (ST). تحتوي كل حجرة تحت الخلية على آلات بروتين محددة (مرتبطة بالغشاء وقابلة للذوبان) ، وميزات جزيئية حيوية ، ومجمعات بروتينية تلعب أدوارا حاسمة مثل النقل الضوئي البصري ، والتدبير المنزلي العام وتخليق البروتين ، والانتقال المشبكي 2,3.
منذ أكثر من 30 عاما ، لوحظت لأول مرة الحركة المتبادلة المعتمدة على الضوء للبروتينات دون الخلوية ، وتحديدا transducin (بعيدا عن نظام التشغيل) و arrestin (نحو نظام التشغيل) ، 4،5،6،7. في وقت مبكر، تم استقبال هذه الظاهرة المرصودة بتشكك، ويرجع ذلك جزئيا إلى ضعف الكيمياء النسيجية المناعية لإخفاء الظهارة8. في أوائل عام 2000 ، تم تأكيد نقل البروتين المعتمد على التحفيز باستخدام تقنية تقسيم فيزيائية صارمة وشاقة9. كشف التقسيم العرضي التسلسلي لشبكية القوارض المجمدة المسطحة المثبتة متبوعة بالنشاف المناعي أن transducin9,10 و arrestin11,12 و recoverin13 كلها تخضع لإعادة توزيع تحت الخلايا استجابة للضوء. ويعتقد أن النقل المدفوع بالضوء لبروتينات الإشارات الرئيسية هذه لا ينظم فقط حساسية سلسلة النقل الضوئي9،14،15 ، ولكن قد يكون أيضا واقيا عصبيا ضد تلف الضوء16،17،18. نظرا لأن نقل البروتين المدفوع بالضوء في القضبان يبدو مهما جدا لبيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، فإن التقنيات التي تسمح بعزل المقصورات تحت الخلوية المختلفة لتحديد توزيع البروتين هي أدوات بحثية قيمة.
حاليا ، هناك عدد قليل من الطرق التي تهدف إلى عزل المقصورات تحت الخلوية قضيب. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق طويلة ويصعب استنساخها ، أو تتطلب كمية كبيرة من عزل الشبكية. على سبيل المثال، تستخدم مستحضرات الجزء الخارجي للقضيب (ROS) عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة19 لفصل ROS عن تجانس الشبكية. تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للبقع الغربية ، ولكن الإجراء يستغرق وقتا طويلا للغاية ويتطلب ما لا يقل عن 8-12 شبكية العين الفئران20. من ناحية أخرى ، تم تنفيذ التقسيم العرضي التسلسلي للفئران المجمدة وشبكية العين الفئران بنجاح في عزل OS ، IS ، CB ، و ST9,11,13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة تقنيا بسبب ضرورة تسطيح شبكية العين الفئرانية الصغيرة والمنحنية للغاية بالكامل لمحاذاة طبقات الشبكية قبل التقسيم العرضي. نظرا لوجود عدد كبير من نماذج الفئران والفئران المعدلة وراثيا التي تلخص أمراض الجهاز البصري ، فإن إنشاء تقنية تفصل بشكل موثوق وسريع وسهل بين مقصورات القضبان الفردية يبشر بالخير في الكشف عن العمليات الفسيولوجية التي تحدث في كل حجرة متخصصة والآليات التي تكمن وراء العمليات البصرية في الصحة والمرض.
لتسهيل هذه التحقيقات ، نصف طريقتين للتقشير تعزلان المقصورات تحت الخلوية للقضيب بسهولة أكبر من البروتوكولات الحالية. تستخدم طريقة التقشير الأولى، المقتبسة من تقنية لفضح الخلايا ثنائية القطب المصنفة بالفلورسنت لتسجيل مشبك التصحيح21، ورق ترشيح السليلوز لإزالة ROS بالتتابع من شبكية العين الفئرانية الحية والمعزولة (الشكل 1). الطريقة الثانية، المقتبسة من إجراء يعزل طبقات خلايا الشبكية الأساسية الثلاث من شبكية العين chick22 و frog23، تستخدم شريطا لاصقا لإزالة الجزء الداخلي من ROS وقضيب (RIS) من شبكية العين المجففة بالتجميد (الشكل 2). يمكن إكمال كلا الإجراءين في 1 ساعة وهما سهل الاستخدام إلى حد كبير. نحن نقدم التحقق من فعالية هذين البروتوكولين للفصل للبقع الغربية من خلال استخدام شبكية العين المتكيفة مع الظلام والمعرضة للضوء من الفئران C57BL/6J لإثبات النقل الناجم عن الضوء لترانسدوكين القضيب (GNAT1) والاعتقالين (ARR1). علاوة على ذلك ، باستخدام طريقة تقشير الشريط ، نقدم أدلة إضافية على أنه يمكن استخدام تقنيتنا لفحص ومعالجة التناقضات بين بيانات توطين البروتين التي تم الحصول عليها بواسطة الكيمياء المناعية (ICC) والبقع الغربية. على وجه التحديد ، أظهرت تقنيتنا أن: 1) بروتين كيناز C-alpha (PKCα) isoform موجود ليس فقط في الخلايا ثنائية القطب ، ولكن أيضا في الفئران ROS و RIS ، وإن كان بتركيزات منخفضة24،25 ، و 2) رودوبسين كيناز (GRK1) موجود في الغالب في عينة نظام التشغيل المعزول. توضح هذه البيانات فعالية تقنيتي التقشير لدينا لفصل وتحديد كمية محددة من بروتينات القضيب والشبكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تؤثر العديد من أمراض الشبكية على خلايا المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يؤدي إلى موت القضيب ، وفي النهاية ، فقدان البصر الكامل37. تم تلخيص جزء كبير من الأصول الجينية والميكانيكية لتنكس الشبكية البشري بنجاح في العديد من نماذج الفئران على مر السنين. وفي هذا السياق، فإن القدرة على…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant EY12155 و EY027193 و EY027387 إلى JC. نحن ممتنون للدكتور سبيريدون ميشالاكيس (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا، باسادينا، الولايات المتحدة الأمريكية) وناتالي تشن (جامعة جنوب كاليفورنيا، لوس أنجلوس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتدقيق المخطوطة. نود أيضا أن نشكر الدكتور سيث روفينز (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) والدكتور يانوس بيتي بيتردي (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير المعدات اللازمة لجمع اللقطات المقدمة من المؤلف. مادة من: كاسي روز وآخرون ، فصل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين الفأر لتحليل البروتين ، التنكس العصبي الجزيئي ، نشر [2017] ، [Springer Nature].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Referencias
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neurociencias. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
