Summary

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Published: November 04, 2021
doi:

Summary

Questo articolo descrive un metodo di preparazione del campione basato sull’inattivazione termica per preservare i peptidi endogeni evitando la degradazione post-mortem, seguito dalla quantificazione relativa utilizzando l’etichettatura isotopica più LC-MS.

Abstract

La peptidomica può essere definita come l’analisi qualitativa e quantitativa dei peptidi in un campione biologico. Le sue principali applicazioni includono l’identificazione dei biomarcatori peptidici della malattia o dello stress ambientale, l’identificazione di neuropeptidi, ormoni e peptidi intracellulari bioattivi, la scoperta di peptidi antimicrobici e nutraceutici da idrolizzati proteici e può essere utilizzato in studi per comprendere i processi proteolitici. Il recente progresso nella preparazione dei campioni, nei metodi di separazione, nelle tecniche di spettrometria di massa e negli strumenti computazionali relativi al sequenziamento delle proteine ha contribuito all’aumento del numero di peptidi identificati e delle peptidome caratterizzate. Gli studi peptidomici analizzano frequentemente i peptidi che sono generati naturalmente nelle cellule. Qui viene descritto un protocollo di preparazione del campione basato sull’inattivazione del calore, che elimina l’attività della proteasi e l’estrazione con condizioni lievi, quindi non vi è scissione dei legami peptidici. Inoltre, viene mostrata anche la quantificazione relativa dei peptidi utilizzando l’etichettatura isotopica stabile mediante metilazione riduttiva delle ammine. Questo metodo di etichettatura presenta alcuni vantaggi in quanto i reagenti sono disponibili in commercio, poco costosi rispetto ad altri, chimicamente stabili e consentono l’analisi di un massimo di cinque campioni in una singola esecuzione LC-MS.

Introduction

Le scienze “omiche” sono caratterizzate dall’analisi approfondita di un insieme di molecole, come DNA, RNA, proteine, peptidi, metaboliti, ecc. Questi set di dati generati su larga scala (genomica, trascrittomica, proteomica, peptidomica, metabolomica, ecc.) hanno rivoluzionato la biologia e portato a una comprensione avanzata dei processi biologici1. Il termine peptidomico cominciò ad essere introdotto all’inizio del 20 ° secolo e alcuni autori si sono riferiti ad esso come una branca della proteomica2. Tuttavia, la peptidomica ha peculiarità distinte, dove l’interesse principale è quello di indagare il contenuto di peptidi generati naturalmente durante i processi cellulari, nonché la caratterizzazione dell’attività biologica di queste molecole3,4.

Inizialmente, gli studi sui peptidi bioattivi erano limitati ai neuropeptidi e ai peptidi ormonali attraverso la degradazione di Edman e il test radioimmunologico. Tuttavia, queste tecniche non consentono un’analisi globale, a seconda dell’isolamento di ciascun peptide in alte concentrazioni, del tempo per la generazione di anticorpi, oltre alla possibilità di cross-reattività5.

L’analisi peptidomica è stata resa possibile solo dopo diversi progressi nella spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida (LC-MS) e nei progetti sul genoma che hanno fornito pool di dati completi per studi di proteomica/peptidomica6,7. Inoltre, è stato necessario stabilire uno specifico protocollo di estrazione peptidica per le peptidome perché i primi studi che hanno analizzato i neuropeptidi a livello globale in campioni di cervello hanno dimostrato che il rilevamento era influenzato dalla massiccia degradazione delle proteine, che si verificano principalmente in questo tessuto dopo 1 minuto post-mortem. La presenza di questi frammenti peptidici mascherava il segnale neuropeptide e non rappresentava il peptidome in vivo. Questo problema è stato risolto principalmente con l’applicazione dell’inattivazione a riscaldamento rapido delle proteasi mediante irradiazione a microonde, che ha ridotto drasticamente la presenza di questi frammenti di artefatti e ha permesso non solo l’identificazione di frammenti neuropeptidici ma ha rivelato la presenza di un insieme di peptidi da proteine citosoliche, mitocondriali e nucleari, diverse da degradome6,8,9.

Queste procedure metodologiche hanno permesso un’espansione del peptidome oltre i ben noti neuropeptidi, dove centinaia di peptidi intracellulari generati principalmente dall’azione dei proteasomi sono stati identificati nel lievito10, nel pesce zebra11, nei tessuti dei roditori12 e nelle cellule umane13. Dozzine di questi peptidi intracellulari hanno ampiamente dimostrato di avere attività sia biologiche che farmacologiche14,15. Inoltre, questi peptidi possono essere utilizzati come biomarcatori di malattia e possibilmente hanno un significato clinico, come dimostrato nel liquido cerebrospinale da pazienti con aneurismi sacculari intracranici16.

Attualmente, oltre all’identificazione di sequenze peptidiche, è possibile attraverso la spettrometria di massa ottenere dati di quantificazione assoluta e relativa. Nella quantificazione assoluta, i livelli peptidici in un campione biologico vengono confrontati con gli standard sintetici, mentre nella relativa quantificazione, i livelli peptidici vengono confrontati tra due o più campioni17. La quantificazione relativa può essere eseguita utilizzando i seguenti approcci: 1) “label free”18; 2) etichettatura metabolica in vivo o 3) etichettatura chimica. Gli ultimi due si basano sull’uso di forme isotopiche stabili incorporate nei peptidi19,20. Nell’analisi senza etichetta, i livelli di peptidi sono stimati considerando la potenza del segnale (conteggi spettrali) durante l’LC-MS18. Tuttavia, l’etichettatura isotopica può ottenere livelli relativi più accurati di peptidi.

Molti studi peptidomici hanno utilizzato reagenti di etichettatura del butirrato trimetilammonio (TMAB) come etichettatura chimica e, più recentemente, sono stati utilizzati la metilazione riduttiva delle ammine (RMA) con forme deuterate e non deuterate di reagenti di formaldeide e cianoboroidruro di sodio11,21,22. Tuttavia, le etichette TMAB non sono disponibili in commercio e il processo di sintesi è molto laborioso. D’altra parte, nell’RMA, i reagenti sono disponibili in commercio, poco costosi rispetto ad altre etichette, la procedura è semplice da eseguire e i peptidi etichettati sono stabili23,24.

L’uso di RMA comporta la formazione di una base di Schiff consentendo ai peptidi di reagire con la formaldeide, seguita da una reazione di riduzione attraverso la cianoboroidruro. Questa reazione provoca la dimetilazione di gruppi amminici liberi su N-terminali e catene laterali di lisina e monometilati Proline N-terminali. Come i residui di prolina sono spesso rari sul N-terminale, praticamente tutti i peptidi con ammine libere sul N-terminus sono etichettati con due gruppi metilici23,24,25.

Protocol

La seguente procedura per l’estrazione peptidica e la metilazione riduttiva è stata adattata dalle procedure precedentemente pubblicate24,25,26,27. Questo protocollo ha seguito le linee guida del Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA) ed è stato approvato dalla Commissione etica per l’uso animale (CEUA) presso l’Istituto di bioscienze dell’Università stat…

Representative Results

I risultati ottenuti dalle esecuzioni effettuate sullo spettrometro di massa sono memorizzati in file di dati grezzi che possono essere aperti nel software dello spettrometro di massa. Negli spettri MS, è possibile osservare gruppi di picco che rappresentano peptidi marcati secondo lo schema di etichettatura utilizzato, che vanno da 2-5 etichette. Ad esempio, nella Figura 2, coppie di picchi rilevati in un tempo cromatografico sono rappresentate in un esperimento in cui sono state utilizzat…

Discussion

Nella maggior parte degli studi peptidomici, uno dei passaggi critici è, senza dubbio, la preparazione del campione che deve essere eseguita con attenzione per evitare la presenza di frammenti peptidici generati dalle proteasi dopo pochi minuti post-mortem. Gli studi iniziali su estratti cerebrali preparati da campioni non microonde hanno mostrato la presenza di un gran numero di frammenti proteici nei microfiltrati 10-kDa. Sono stati descritti diversi approcci per evitare spettri peptidici dalla degradazione delle prot…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo sviluppo e l’uso delle tecniche qui descritte sono stati supportati dalla sovvenzione del Consiglio Nazionale delle Ricerche brasiliano 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) sovvenzioni 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) e 21/01286-1 (MEME). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione dell’articolo.

Materials

10 kDa cut-off filters Merck Millipore UFC801024 Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Acetonitrile Sigma-Aldrich 1000291000
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 11213
analytical column (EASY-Column) EASY-Column (SC200)  10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 MS-222
Fluorescamine Sigma-Aldrich F9015
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde-13C, d2, solution Sigma-Aldrich 596388
Formaldehyde-d2 solution Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Sigma-Aldrich 33015
Fume hood Quimis Q216
Hydrochloric acid – HCl Sigma-Aldrich 258148
LoBind-Protein retention tubes Eppendorf EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific LTQ Velos
Microwave oven Panasonic NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC Thermo Fisher Scientific LC140
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions Inc. VERSION 8.5
Phosphate-buffered saline Invitrogen 3002 tablets
precolumn (EASY-Column) Thermo Fisher Scientific (SC001) 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1
Refrigerated centrifuge Hermle Z326K for conical tubes
Refrigerated centrifuge Vision VS15000CFNII for microtubes
Reversed-phase cleanup columns   (Oasis HLB 1 cc Cartridge) Waters 186000383 Oasis HLB 1 cc Cartridge
Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN Sigma-Aldrich 190020
Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN Sigma-Aldrich 156159
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763 NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sonicator Qsonica Q55-110
Standard peptide Proteimax amino acid sequence: LTLRTKL
Triethylammonium buffer – TEAB 1 M Sigma-Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid – TFA Sigma-Aldrich T6508
Ultra purified water Milli-Q Direct-Q 3UV
Vacuum centrifuge GeneVac MiVac DNA concentrator
Water bath Cientec 266
Xcalibur Software ThermoFisher Scientific OPTON-30965

Referencias

  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
  4. Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
  5. Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
  6. Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
  7. Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
  8. Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
  9. Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
  10. Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
  11. Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
  12. Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
  13. Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
  14. De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
  15. Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
  16. Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
  17. Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
  18. Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
  19. Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
  20. Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
  21. Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
  22. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  23. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  24. Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
  25. Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
  26. Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
  27. Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
  28. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
  29. Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
  30. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
  31. Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
  32. Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
  33. Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  34. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).

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Correa, C. N., Fiametti, L. O., Mazzi Esquinca, M. E., Castro, L. M. d. Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies. J. Vis. Exp. (177), e62971, doi:10.3791/62971 (2021).

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