Summary

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Published: July 25, 2022
doi:

Summary

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Abstract

La microglía, como macrófagos residentes en el cerebro, es fundamental para varias funciones, incluida la respuesta al estrés ambiental y la homeostasis cerebral. La microglía puede adoptar un amplio espectro de fenotipos de activación. Además, la microglía que respalda el fenotipo proinflamatorio se asocia con trastornos del desarrollo neurológico y neurodegenerativos. Los estudios in vitro son ampliamente utilizados en la investigación para evaluar posibles estrategias terapéuticas en tipos específicos de células. En este contexto, el estudio de la activación microglial y la neuroinflamación in vitro utilizando cultivos microgliales primarios es más relevante que las líneas celulares microgliales o la microglía derivada de células madre. Sin embargo, el uso de algunos cultivos primarios puede adolecer de una falta de reproducibilidad. Este protocolo propone un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos. Aquí se demuestra la activación microglial utilizando varios estímulos después de 4 h y 24 h mediante la cuantificación de la expresión de ARNm y un ensayo fagocítico de perlas Cy3. Se espera que el trabajo actual proporcione una técnica fácilmente reproducible para aislar microglía fisiológicamente relevante de las etapas de desarrollo juvenil.

Introduction

Las microglías son las células similares a los macrófagos residentes en el sistema nervioso central derivadas de precursores eritropoyéticos del saco vitelino que migran al neuroepitelio durante el desarrollo embrionario temprano1. Además de sus funciones de inmunidad, también juegan un papel importante durante el neurodesarrollo, particularmente para la sinaptogénesis, la homeostasis neuronal y la mielinización2. En la edad adulta, la microglía desarrolla largos procesos celulares para escanear el medio ambiente continuamente. En caso de rupturas de homeostasis como lesión cerebral o enfermedad cerebral, la microglía puede cambiar su apariencia morfológica para adoptar una forma ameboide, migrar a la zona lesionada, aumentar y liberar muchos factores citoprotectores o citotóxicos. Las microglías tienen estados de activación heterogéneos dependiendo de su etapa de desarrollo y del tipo de lesión sufrida 3,4,5. En este estudio, estos estados de activación se clasifican ampliamente en tres fenotipos diferentes: proinflamatorio/fagocítico, antiinflamatorio e inmunorregulador, teniendo en cuenta que, en realidad, la situación es probable que sea más compleja6.

El estudio de la activación microglial in vivo y la detección de estrategias neuroprotectoras en las primeras etapas del desarrollo cerebral puede ser un desafío debido a (1) la fragilidad de los animales antes del destete y (2) el bajo número de células microgliales. Por lo tanto, los estudios in vitro sobre la microglía son ampliamente utilizados para la toxicidad 7,8,9, las estrategias neuroprotectoras5,10,11,12,13,14 y los cocultivos 15,16,17,18,19,20,21 . Los estudios in vitro pueden utilizar líneas celulares microgliales, microglía derivada de células madre o cultivo primario de microglia. Todos estos enfoques tienen ventajas y desventajas, y la elección depende de la pregunta biológica inicial. Los beneficios del uso de cultivos primarios de microglia son los antecedentes genéticos homogéneos, la historia libre de patógenos y el control del momento en que la microglía es estimulada después de la muerte animal22.

A lo largo de los años, se desarrollaron diferentes métodos (citometría de flujo, agitación o marcado magnético) para cultivar microglia primaria de roedores, tanto neonatos como adultos 23,24,25,26,27,28,29. En el presente trabajo, el aislamiento de microglia de crías neonatales de ratón se realiza utilizando la tecnología de clasificación celular activada magnéticamente previamente descrita utilizando CD11b de ratón anti-ratón recubierto de microperlas25,27,29. CD11b es un receptor de integrina expresado en la superficie de las células mieloides, incluida la microglía. Cuando no hay un desafío inflamatorio dentro del cerebro, casi todas las células CD11b + son microglia30. En comparación con otros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, el presente protocolo equilibra los análisis de activación microglial ex vivo inmediato y el cultivo microglial primario in vitro común. Por lo tanto, las microglías son (1) aisladas en el día postnatal (P)8 sin eliminación de mielina, (2) cultivadas sin suero, y (3) expuestas a siRNA, miRNA, compuesto farmacológico y/o estímulos inflamatorios solo 48 h después del aislamiento cerebral. Cada uno de estos tres aspectos hace que el protocolo actual sea relevante y rápido. En primer lugar, el uso de la microglía pediátrica permite obtener células viables dinámicas y reactivas en cultivo sin requerir un paso adicional de desmielinización que podría modificar potencialmente la reactividad microglial in vitro. El presente protocolo tiene como objetivo acercarse lo más posible al entorno fisiológico de la microglía. De hecho, la microglía nunca encuentra suero, y este protocolo tampoco requiere el uso de suero. Además, la exposición de la microglía tan pronto como 48 h después del cultivo evita que pierdan sus facultades fisiológicas.

Protocol

El protocolo fue aprobado, y todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices institucionales del Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Se presenta el aislamiento magnético de la microglía del cerebro de 24 crías de ratón OF1 (tanto machos como hembras) en P8, divididas en placas de 6 pocillos, 12 pocillos o 96 pocillos. El trabajo experimental se realizó bajo una campana para mantener condiciones estériles. 1. Preparaci…

Representative Results

La microglía es el macrófago residente en el SNC que se activa cuando se expone a desafíos ambientales (trauma, moléculas tóxicas, inflamación)4,5,6,34 (Figura 3A). Los estudios in vitro sobre la microglía se utilizan comúnmente para evaluar los mecanismos autónomos celulares relacionados con esos desafíos ambientales y caracterizar el estado de …

Discussion

El trabajo actual presenta un cultivo primario de células microgliales utilizando células CD11b + clasificadas magnéticamente. Además de la evaluación funcional microglial (RT-qPCR y ensayos fagocíticos), también se determinó la pureza del cultivo microglial.

Los cultivos clásicos de células microgliales se generan comúnmente a partir del cerebro neonatal de roedores P1 o P2 y el cocultivo con astrocitos durante al menos 10 días. Las microglías se separan mecánicamente usando un …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las figuras fueron creadas usando BioRender. La investigación está financiada por Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, y una subvención adicional de Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388

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Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).

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