Omfattande in vitro-modeller som troget rekapitulerar den relevanta mänskliga sjukdomen saknas. Den aktuella studien presenterar tredimensionella (3D) tumör sfäroid skapande och kultur, ett tillförlitligt in vitro verktyg för att studera tumör-stromal interaktion i mänskliga hepatocellular carcinom.
Aggressivitet och brist på väl tolererade och allmänt effektiva behandlingar för avancerade hepatocellulära carcinom (HCC), den dominerande formen av levercancer, rationaliserar sin rang som den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död. Prekliniska modeller måste anpassas för att rekapitulera de mänskliga förhållandena för att välja de bästa terapeutiska kandidaterna för klinisk utveckling och hjälpa till att leverera personlig medicin. Tredimensionella (3D) cellulära sfäroidmodeller visar löfte som ett framväxande in vitro-alternativ till tvådimensionella (2D) monolayerkulturer. Här beskriver vi en 3D tumör sfäroid modell som utnyttjar enskilda cellers förmåga att aggregera när den underhålls i hängande droppar, och är mer representativ för en in vivo miljö än vanliga monolayers. Dessutom kan 3D-sfäroider produceras genom att kombinera homotypiska eller heterotypiska celler, mer reflekterande av den cellulära heterogeniteten in vivo, vilket potentiellt möjliggör studier av miljöinteraktioner som kan påverka progression och behandlingssvar. Den aktuella forskningen optimerade celltätheten för att bilda 3D homotypiska och heterotypiska tumörsfäroider genom att immobilisera cellupphängningar på locken på standard 10 cm3 Petri-rätter. Longitudinell analys utfördes för att generera tillväxt kurvor för homotypiska kontra heterotypiska tumör/fibroblasts sfäroider. Slutligen undersöktes proliferative effekten av fibroblaster (COS7 celler) och lever myofibroblasts (LX2) på homotypiska tumör (Hep3B) sfäroider. En såddtäthet på 3 000 celler (i 20 μL-media) gav framgångsrikt Huh7/COS7 heterotypiska sfäroider, som visade en stadig ökning av storleken upp till kulturdag 8, följt av tillväxtstörning. Detta konstaterande bekräftades med Hjälp av Hep3B homotypiska sfäroider odlade i LX2 (mänskliga lever stellate cellinjen) betingade medium (CM). LX2 CM utlöste spridningen av Hep3B sfäroider jämfört med kontroll tumör sfäroider. Sammanfattningsvis har detta protokoll visat att 3D tumör sfäroider kan användas som ett enkelt, ekonomiskt och prescreen in vitro verktyg för att studera tumör-stromal interaktioner mer omfattande.
Den globala incidensen och dödligheten i levercancer har fortsatt att öka, trots framsteg i behandlingarna av leversjukdom och de flesta andra typer av cancer. Under 2018 överträffade levercancer kolorektal- och magcancer för att bli den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död globalt1. År 2020 fanns det mer än 9 00 000 nya diagnoser, vilket motsvarar 4,7% av de totala cancerfallen över hela världen1. Detta är särskilt nedslående, med tanke på att de betydande riskfaktorerna för utvecklingen av HCC, den vanligaste formen av levercancer, är väl karakteriserade2. Cirros är den vanligaste riskfaktorn för utvecklingen av HCC, med 80% av fallen som utvecklas mot bakgrund av etablerad cirros2. Kroniska leversjukdomar, som utvecklas till cirros, och följaktligen HCC, inkluderar hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), alkoholrelaterad leversjukdom (ARLD), alkoholfria fettleversjukdomar (NAFLD) – den senare tillskrivs fetma och typ 2-diabetes mellitus (T2DM)2,3. De nuvarande hanteringsprotokollen för HCC är stegberoende och begränsade för dem med avancerad cancer, som oftast har ett dåligt resultat4. Det har gjorts betydande framsteg med kinashämmare och, mer nyligen, immun-onkologi behandlingar, även om realistiskt, gynnar endast en minoritet av patienter med avancerad levercancer5. Dessutom finns det en oro för att HCCs som uppstår hos patienter med NAFLD – den snabbast växande underliggande orsaken, som står för mer än 50% av nydiagnostiserade HCC-fall i västländer, kan vara mer resistenta mot programmerad död 1 (PD1) checkpoint inhibitor terapi6.
Det har gjorts en massiv investering i kliniska prövningar för patienter med HCC, inklusive betydande förbättringar i kliniska prövningar och deras endpoints7. Efter ett decennium av misslyckanden har dessa investeringar börjat förändra möjligheterna för patienter. Verkligheten är dock att den totala andelen svarande fortfarande är relativt dålig, med patienter som rekryteras till prövningar som ofta dåligt representerar dem som vårdas på klinikerna. Faran är att förskotten blir kostsamma och gynnar de få snarare än de många. Eftersom fler kandidatterapier dyker upp för engångsanvändning eller kombination är det viktigt att ha prekliniska modeller som är mer prediktiva för in vivo-svar. Dessa är sannolikt modeller som innehåller ytterligare faktorer som bidrar till den variabilitet som ses i patientens svar som bättre återspeglar mänskliga HCC heterogenitet och patologisk komplexitet8. System som återskapar de in vivo patofysiologiska förhållandena i HCC behövs för att förstå biologin för tumör evolution, tillväxt och progression. De befintliga experimentella modellerna av kroniska leversjukdomar och HCC faller vanligtvis under tre huvudkategorier: in vivo djurbaserade modeller (granskade i9), in vitro-kulturer10 och ex vivo11,12-modeller. Djurbaserade metoder används i stor utsträckning för att studera kroniska leversjukdomar, inklusive HCC; Den genetiska variabiliteten, de höga driftskostnaderna och de olika immunsystemen mellan arter är dock några av de viktigaste begränsningarna för tillämpningen av sådana modeller9. Medan vissa ex vivo-modeller ger ett utmärkt verktyg för att fokusera på mänskliga vävnader jämfört med andra in vitro-celllinjemodeller, hindrar vävnadstillgänglighet och den begränsade experimentella tidskursen deras användning i stor skala.
Å andra sidan är in vitro-celllinjemodellerna fortfarande ett bra alternativ för forskare som arbetar med begränsade resurser, med ett mindre behov av att ha en konstant tillgång på färska mänskliga vävnader10. Dessa modeller ger också ett verktyg som kan användas som en första skärm för att hjälpa till med målval av läkemedelsval innan de fortsätter till mer komplexa in vivo-modeller. Den senaste ändringen av de traditionella 2D-monolayerkulturerna i 3D-kulturer har förbättrat effekten av dessa in vitro-modeller13,14.
3D in vitro modeller kan rekapitulera kritiska funktioner sett i mänskliga normala och patologiska villkor. Under fysiologiska förhållanden initieras signaltransduktion genom cellulär korsstjälk och interaktion med andra bindvävsmolekyler, nämligen de extracellulära matrisproteinerna (ECM), som bildar ett 3D-interaktionsnätverk15,16. Tumör utvecklas i en 3D sfärisk form under maligna omvandling, för vilka syre och näringsämnen är lätt rikliga i icke-tumör/tumör interfas. Samtidigt dominerar hypoxiska tillstånd vid tumörkärnan. Denna heterogenitet i näringsämne tillgänglighet resulterar i aktivering av rumsligt distinkt signalering och metaboliska vägar som reglerar tumorigenesis. Dessa villkor är dåligt rekapitulerade i de konventionella 2D monolayerkulturerna14, där celler växer på styv kulturplast på ett fysiologiskt irrelevant sätt. Cancerceller kommunicerar också med andra icke-parenkymala celler, den primära källan till ECM, tillväxt och invasion signalering inom tumör microenvironment. Till skillnad från 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller ge en mer lämplig plattform för att studera denna tumör-stromal interaktion17.
3D-modeller används ofta inom HCC-fältet, och de varierar i hur mikrovävnaden bildas18,19,20,21,22,23. De flesta av dessa modeller använde antingen de ultralåga bindningsplattorna18,19,20,21,22 eller transbrunnarna23 i processen för sfäroidbildning. Protokollet beskrivs introducerar hängande dropp teknik som en alternativ, plastfri och kostnadseffektiv in vitro 3D tumör sfäroid modell. Detta kan underlätta bedömning av parakrina och autokrin roller fibroblaster på spridningen av tumör cellerna i ett 3D-format.
Det sammanhang i vilket de experimentella cellinjerna växer påverkar deras genuttrycksprofil, väganalys och funktionella kriterier. Till exempel, i bröstcancerceller, bibehållas samordningen mellan olika onkogena vägar endast om cancerceller odlas i 3D-konformation27. Avreglerade gener i 3D-melanom och bröstcancersfäroider, men inte i monolayercellerna, är mer relevanta för in vivo-tumören28,29. Till exempel var β1 integrin nivåer i bröst epitelial celler och tumör motsvarigheter lägre än nivåer som odlas i ett 2D-format29. Dessutom tenderar fibroblaster i 3D-strukturer att migrera tydligt när det gäller morfologi och hastighet jämfört med de som odlas på plast30. Dessutom aktiverar den mekaniska styvheten hos tillväxtsubstratet specifika vägar som uppmuntrar den maligna omvandlingen av normala epitelceller via avreglering av det extracellulära signalreglerade kinaset (ERK)/Rho i epitelceller31. Dessa faktorer gynnar övergången från konventionell 2D-kultur till 3D-sfäroidmodeller, eftersom 3D-kulturer är mer i linje med mänsklig sjukdom.
Den aktuella studien använde konventionella laboratorieverktyg och förnödenheter för att producera en 3D-tumörsfäroidmodell. De bildade sfäroiderna svarade på spridningssignalerna som kom från fibroblaster, vilket framgår av deras signifikant ökade tillväxt. Denna modell tillhör kategorin multicellulära tumör sfäroider. det finns tre andra kategorier av 3D tumör sfäroider, inklusive tumorospheres32, vävnad-härledda tumör sfärer33,34 och organotypiska multicellulära sfäroider35. I multicellulära tumör sfäroider suspenderas tumörceller i låg vidhäftningsförhållanden så att de kan aggregeras tillsammans för att bilda sfärer utan att röra botten av odlingskärlet36. Flera metoder har använts för att leverera denna förankringsoberoende teknik, allt från roterande system, vätskeöverläggstekniker och obestrukna ultralåga fastsättning U-formade plattor37. I HCC använder de flesta in vitro-sfäroidkulturer de ultralåga 24- eller 96-brunnsplattorna för att bilda rundade sfäroider18,19,20,21,22. Denna teknik är dock inte kostnadseffektiv och utesluter inte oavsiktlig kontakt med cell-plast. Andra system använder transbrunnar23 eller leverskivor12 för att producera levermikrovävnader. Att använda mänskliga vävnader i translationellt arbete är guldstandarden men inte alltid tillgänglig eller tillgänglig för många forskargrupper. Det nuvarande tillvägagångssättet gynnades av den hängande droppteorin. Cell suspension läggs till så att tumör sfäroiderna bildas i ett tillgängligt vätskeluftgränssnitt för att bilda enkel rundade sfärer38. Fördelarna med att använda denna teknik är bristen på någon cell-plast kontakt och lättheten att studera autokrina och parakrina korstalk mellan tumör och fibroblast celler. Denna modell validerades ytterligare i en annan studie dechiffrera vikten av icke-parenchymal TREM2 för att skydda levern från HCC utveckling39. Detta arbete visade att volymen av både Hep3B och PLC/PRF5 sfäroider var högre i kontroll LX2 CM jämfört med TREM2-överuttryck LX2 CM på ett Wnt-beroende sätt39.
I den aktuella studien blandades fibroblaster med tumörceller före sfäroidbildning för att undersöka den proliferativa effekten av denna samkultur. Andra har lagt till fibroblaster, endotelceller och immunceller med tumörcellsupphängning efter att ha bildat en tumörsfäroid för att studera stromal cellmigration till tumören40,41. Den nuvarande heterotypiska sfäroid modellen visade ett liknande tillväxtmönster som de tidigare rapporterade modellerna och den ursprungliga in vivo tumör. sfäroider visar exponentiell tillväxt följt av en fördröjd tillväxtfas, troligen på grund av utarmning av näringsämnen och utvidgningen av den necrotic core42. Istället för att lägga till tillväxtfaktorer och mitogener för att hjälpa sfäroidbildning, använde denna studie ett mer fysiologiskt tillvägagångssätt genom att ha dessa tillväxtfaktorer från direkt kontakt med fibroblaster eller deras sekret i fibroblast CM. Det är viktigt att nämna att LX2-celler kan aktiveras ytterligare genom behandling med TGFβ1 eller PDGF43. LX2 celler har behandlats med 10 ng/mL TGFβ1 för 48 h innan du tar bort media för olika experimentella inställningar. LX2 celler tvättades tre gånger med PBS (för att utesluta någon direkt TGFβ1 effekt), och sedan färska medier lades till i ytterligare 24 h innan du samlar CM. Cm som samlats in från TGFβ1-stimulerad LX2 inducerade Hep3B-sfäroidernas tillväxt i en högre takt än CM från kontroll LX2 (data visas inte). Detta flexibla system kan låna sig till samkulturer av olika cancerceller plus / minus fibroblaster, liksom patientbaserade linjer. Det kan också erbjuda en medium-throughput screening analys för läkemedel som snabbt kan antas och infogas i en translationell drogupptäckt pipeline för att informera dosering för in vivo studier.
En begränsning av den aktuella studien är användningen av de odödliga cellinjerna i sfäroidbildning snarare än nyisolerade HCC-tumörceller och cancerassocierade fibroblaster. En annan begränsning är att jämföra homotypiska Hep3B sfäroid tillväxt mellan CM från LX2 och i färska medier snarare än CM från andra icke-fibroblast cellinjer. Den senare begränsningen kan åtgärdas genom genetisk modifiering av en gen av intresse för fibroblaster följt av tillämpning av CM från vild typ kontra genetiskt konstruerad fibroblast på homotypiska sfäroider.
The authors have nothing to disclose.
MYWZ finansieras av The Secretary of State for Business, Energy and Industrial Strategy och Newton Prize 2020 som en del av Storbritanniens officiella utvecklingsbistånd “ODA” och Newton-fonden. SS stöds av Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959. SS, FO och HR erhåller finansiering som en del av HUNTER, finansierat genom ett partnerskap mellan Cancer Research UK, Fondazione AIRC och Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.
1x Trypsin | Sigma Aldrich | 59429C | |
2 mL tubes | Eppendorf | ||
Biorender | Biorender.com | Online | |
Class II laminar flow BioMAT2 hood | Medair Technologies | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Biosera | M-D1107 | |
Excel sofware | Microsoft office 365 | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) | life tech | 105000064 | |
Image J software | Fiji | ||
L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513-100ml | |
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
Petri dish 90 mm, triple vented | Greiner | 633175 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket | Rely+On™ | SCI-129999 | |
Ziess inverted microscope | Ziess |