使用高通量荧光标记成像以及自动统计分析方法,基于表型粘附性检测宿主 – 细菌病原体相互作用,可以快速评估细菌与宿主细胞的潜在相互作用。
识别新出现的细菌病原体对人类健康和安全至关重要。细菌对宿主细胞的粘附是细菌感染的重要步骤,并构成潜在威胁的标志。因此,检查细菌对宿主细胞的粘附性可以用作细菌威胁评估的一个组成部分。枚举细菌对宿主细胞的粘附的标准方法是将细菌与宿主细胞共同孵育,收获贴壁细菌,将收获的细胞接种在固体培养基上,然后计算所得的菌落形成单位(CFU)。或者,可以使用基于免疫荧光显微镜的方法评估细菌对宿主细胞的依从性。然而,实施这些方法的传统策略既耗时又低效。在这里,描述了最近开发的基于自动荧光显微镜的成像方法。当与高通量图像处理和统计分析相结合时,该方法可以快速定量粘附在宿主细胞上的细菌。测试了两种细菌物种,铜绿革兰氏阴 性假单胞菌 和革兰氏阳性 单核细胞增多性李斯特菌 以及相应的阴性对照,以证明方案。结果表明,这种方法可以快速准确地枚举贴附细菌,并显着减少实验工作量和时间表。
细菌粘附是细菌附着在其他细胞或表面上的过程。细菌病原体感染的成功建立需要粘附于宿主细胞,定植组织,并且在某些情况下,侵入宿主细胞1,2,3。新出现的传染病构成重大的公共卫生威胁,最近的COVID-19大流行4,5,6证明了这一点。重要的是,使用基于基因组的方法可能无法轻易识别新的或正在出现的病原体,特别是在病原体被设计为逃避检测或不包含将其识别为致病性的基因组特征的情况下。因此,使用直接评估致病性特征的方法(如细菌对宿主细胞的粘附性)鉴定潜在病原体可以在病原体鉴定中起关键作用。
细菌对宿主细胞的粘附性已被用于评估细菌发病机制数十年1,7。显微成像8、9和通过感染后电镀枚举细菌集落形成单元(CFU)10、11、12、13是两种成熟的实验室方法,用于测试微生物的粘附和/或宿主细胞的感染14。考虑到细菌细胞的微米级大小,贴壁细菌细胞的枚举通常需要使用先进的高倍率显微镜技术,以及高分辨率成像方法,包括电子显微镜,膨胀显微镜(ExM)15,16和三维成像17.或者,可以通过在固体琼脂上接种收获的细菌的稀释系列并计数所得的CFU10,12,13来计数与宿主细胞结合或内化在宿主细胞内的细菌的枚举。这种方法费力,包括许多手动步骤,这给建立高通量分析所需的标准化或自动化程序带来了困难18,19。因此,开发用于评估宿主细胞附着的新方法将解决该领域当前的局限性。
这里描述了一种这样的方法,它使用自动化高通量显微镜,结合高通量图像处理和统计分析。为了证明这种方法,对几种细菌病原体进行了实验,包括铜绿假单胞菌,一种人类,动物和植物的机会性革兰氏阴性细菌病原体14,20,它经常被发现定植于宿主防御功能受损患者的呼吸道。这种方法优化了先前研究14,20中描述的显微成像过程。通过荧光标记的宿主细胞和细菌简化了成像检测,以快速跟踪它们的接近程度,这大大减少了显微镜工作量,以获得用于区分细菌的高分辨率图像。此外,对计数宿主细胞和细菌中的图像进行自动统计分析取代了细菌CFU接种的动手实验,以估计每个宿主细胞的贴壁细菌计数的比率。为了证实该方法的相容性,还测试了多种细菌菌株和宿主细胞类型,如单核细胞增多性李斯特菌,金黄色葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌,以及人脐静脉内皮细胞(HUVECs),结果支持该方法的多样性和有效性。
该协议描述了一种用于枚举细菌附着在宿主细胞上的自动化方法。与传统方法相比,所描述的方法具有几个有吸引力的优点。首先,这种方法能够精确定量附着在单个宿主细胞上的微生物病原体细胞的数量。重要的是,这种定量可以在不需要费力的细菌收获,连续稀释,在固体培养基上电镀以及CFU10,11,12的测定的情况下进行…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Biotek Inc.的Kaite Zlotkowski博士的技术支持。这项工作得到了国防部的支持,合同号为W911NF1920013到PdF,国防高级研究计划局(DARPA)和内政部根据合同号140D6319C0029到PdF。资料的内容不一定反映政府的立场或政策,不应推断官方认可。
10x PBS | VWR | 45001-130 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
E. coli | Laboratory stock | ||
EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
EHEC | NIST collections | ||
F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
HUVEC | Laboratory stock | ||
L. monocytogenes | NIST collections | ||
OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
S. agalactiae | NIST collections | ||
S. aureus | BEI | NR-46543 | |
S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
S. rubidaea | NIST collections | ||
Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |