ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出
Summary
高スループット蛍光標識イメージングを用いた表形性付着に基づく宿主菌病原体相互作用の検出と、自動化された統計解析法により、宿主細胞との潜在的な細菌相互作用の迅速な評価が可能になります。
Abstract
新興細菌病原体の同定は、人間の健康と安全のために重要です。宿主細胞への細菌の付着は、細菌感染に不可欠なステップであり、潜在的な脅威の特徴を構成する。したがって、宿主細胞への細菌の付着を調べることは、細菌の脅威評価の構成要素として使用することができる。宿主細胞への細菌付着を列挙する標準的な方法は、細菌を宿主細胞と共培養し、接着細菌を収穫し、採取した細胞を固体培地にプレートし、次いで得られたコロニー形成単位(CFU)を数える。あるいは、宿主細胞への細菌付着は、免疫蛍光顕微鏡ベースのアプローチを用いて評価することができる。しかし、これらのアプローチを実装するための従来の戦略は、時間がかかり、非効率的です。ここでは、最近開発された自動蛍光顕微鏡ベースのイメージング方法について説明する。高スループット画像処理と統計解析と組み合わせると、宿主細胞に付着する細菌の迅速な定量が可能になります。2つの細菌種、グラム陰性 シュードモナス緑膿菌 およびグラム陽性 リステリア単球遺伝子 および対応する陰性対照を、プロトコルを実証するために試験した。この結果は、このアプローチが迅速かつ正確に付着細菌を列挙し、実験的な作業負荷とタイムラインを大幅に減少させることを示しています。
Introduction
細菌接着は、細菌が他の細胞または表面に付着するプロセスです。細菌病原体による感染の確立に成功するには、宿主細胞への接着、組織のコロニー形成、および場合によっては宿主細胞1、2、3の侵入が必要である。最近のCOVID-19パンデミック4、5、6によって証明されるように、新興の感染症は、主要な公衆衛生上の脅威を構成します。重要なことに、新しい病原体または新興病原体は、特に検出を回避するように設計された場合、または病原体として識別するゲノムシグネチャを含まない場合に、ゲノムベースのアプローチを使用して容易に識別できない可能性があります。したがって、宿主細胞への細菌付着のような病原性の特徴を直接評価する方法を用いて潜在的な病原体の同定は、病原体の同定において重要な役割を果たすことができる。
宿主細胞への細菌の付着は、数十年にわたり細菌病態のメカニズムを評価するために用いられてきた。顕微鏡イメージング8、9および細菌コロニー形成ユニット(CFU)10、11、12、13の列挙体は、感染後めっきによる、宿主細胞14の微生物の付着および/または感染を試験するための2つのよく発達した実験室法である。細菌細胞のマイクロメートルスケールサイズを考慮すると、接着性細菌細胞の列挙体は、一般的に高度な高倍率顕微鏡技術の使用と、電子顕微鏡、拡張顕微鏡(ExM)15、拡張顕微鏡検査(ExM)15、16、3次元画像化を含む高解像イメージングアプローチを使用する必要があります。.あるいは、宿主細胞内に結合または内在化された細菌の列挙は、固体寒天上に収穫された細菌の希釈系列をめっきし、得られたCFUs10、12、13を数えることによって行うことができる。この方法は面倒で、多くの手動ステップが含まれており、高スループット分析18、19に必要な標準化されたまたは自動化された手順を確立するのが困難になります。したがって、ホスト セルの添付ファイルを評価するための新しいメソッドの開発は、フィールドの現在の制限に対処します。
ここでは、高スループットの画像処理と統計解析を組み合わせて、自動ハイスループット顕微鏡を使用する方法の1つについて説明します。このアプローチを実証するために、ヒト、動物、植物14,20の日和見グラム陰性細菌病原体である緑膿菌を含むいくつかの細菌病原体を用いた実験が行われ、宿主防御機能障害を有する患者の気道を植民地化することが頻繁に見出される。このアプローチは、これまでの研究14,20に記載された顕微鏡イメージングプロセスを最適化した。蛍光標識された宿主細胞および細菌によって画像検出が単純化され、それらの近接性を迅速に追跡し、顕微鏡の作業負荷を劇的に減少させ、細菌を区別するための高解像度画像を得た。さらに、ホスト細胞および細菌を計数中の画像の自動統計分析は、細菌CFUめっきの手実験に取って代わり、宿主細胞あたりの付着細菌数の比率を推定した。この方法の適合性を確認するために、リステリア単球遺伝子、黄色ブドウ球菌、セレウス属、肺炎のクレブシエラ、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)など、複数の細菌株および宿主細胞タイプも試験されており、その結果、この方法の多様性と有効性を裏付けています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ホスト細胞への細菌の愛着を列挙するための自動化されたアプローチを記述します。記載されたアプローチは、従来の方法に比していくつかの魅力的な利点を有する。まず、このアプローチにより、個々の宿主細胞に結合する微生物病原菌細胞の数を正確に定量化することが可能となる。重要なことに、この定量は、面倒な細菌収穫、連続希釈、固体培地上のめっき、お?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
バイオテック社のカイテ・ズロトコフスキ博士の技術サポートに感謝しています。この作業は、PdF、国防高等研究プロジェクト庁(DARPA)、およびPdFへの契約番号140D6319C0029の下で内務省に契約番号W911NF1920013の下で国防総省によってサポートされました。情報の内容は、必ずしも政府の立場や政策を反映しているものではなく、公式の支持を推測してはならない。
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
Referencias
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
