樹状突起棘は神経系の重要な細胞の特徴です。ここでは、 C. elegansにおける樹状突起スパインの構造および機能を評価するためのライブイメージング法について説明する。これらのアプローチは、樹状突起スパインの形状または機能を定義する遺伝子の変異スクリーニングの開発をサポートします。
樹状突起棘は、活動によって調節されるシナプス神経支配の特殊な部位であり、学習と記憶の基質として機能します。近年、DD GABA作動性ニューロンに対して樹状突起スパインが、 カエノラブディティス・エレガンスの運動回路におけるシナプス前コリン作動性ニューロンからの入力部位として記載されている。このシナプス回路は、脊椎の形態形成と機能の強力な 新しいin vivo モデルとして機能し、Cの容易な遺伝学とすぐにアクセスできるものを利用することができます 。 生細胞イメージングへのエレガンス。
このプロトコルは、DDスパインの構造と機能を評価するための実験戦略について説明しています。このアプローチでは、超解像イメージング戦略を使用して、アクチンに富む樹状突起スパインの複雑な形状を視覚化します。DDスパイン機能を評価するために、光活性化オプシンであるクリムゾンはシナプス前コリン作動性ニューロンを刺激し、カルシウムインジケーターGCaMPはシナプス後DDスパインの誘発されたカルシウム過敏性を報告します。一緒に、これらの方法は、脳内の脊椎の形態形成と機能を指示する可能性のある C.エレガンスの 樹状突起スパインの遺伝的決定要因を特定するための強力なアプローチで構成されています。
樹状突起スパインは、シナプス伝達のために隣接するニューロンからの入力を受け取る特殊な細胞構造です。神経伝達物質受容体の活性化は、これらの特徴的な神経突起における細胞内カルシウムおよび下流のシグナル伝達経路を上昇させる1。神経伝達に対する樹状突起スパインの基本的な重要性と神経発達疾患におけるそれらの誤制御1のために、樹状突起スパインの形態形成と機能を調節する因子の発見は、神経科学の分野にとって非常に興味深いものです。
最近、樹状突起棘は、哺乳類の棘と共有される重要な特性に基づいて、C.エレガンス神経系で同定されました2。この決定は、脊椎生物学を調査するためにC.エレガンスの利点を利用する可能性を開くため、非常に重要です。背側D(DD)運動ニューロンの樹状突起スパインは、腹側神経索のコリン作動性ニューロン(VAおよびVB)から入力を受け取ります(図1A)2,3,4。ここでは、DD樹状突起スパインの構造と、ライブイメージングと遺伝子分析に容易にアクセスできる無傷の神経系におけるin vivoでのそれらの機能を探索するためのイメージング方法を紹介します。樹状突起スパインの形状をモニタリングするために、(1)樹状突起およびスパインを満たす細胞質蛍光タンパク質;(2)樹状突起スパインと樹状突起の境界を飾る膜結合蛍光タンパク質;または(3)樹状突起棘に富むアクチンマーカーであるLifeAct5またはUtrophin6を使用して、それらの形状を明らかにします。DDスパインの機能を監視するために、GCaMP蛍光を使用して、シナプス前コリン作動性ニューロン7における赤方偏移オプシンクリムゾンの活性化によって引き起こされるCa++トランジェントを検出します。どちらの戦略も、野生型および変異動物におけるDD樹状突起スパインの研究を促進することが期待されています。
Airyscan検出器は、従来の共焦点顕微鏡よりも高い信号対雑音比と優れた解像度を提供するため、DDスパインのスナップショットを取得するために選択されました19,20。AiryScanイメージングでは、従来の蛍光タンパク質(GFP、mCherryなど)の使用も可能になり、現在ではC.エレガンスに広く利用可能です。他の超解像法(例えば、STORM、STED、PALM)を用いてより高い解像度の画像を得ることができるが、これらの方法は、光活性化可能または光切り替え可能な蛍光タンパク質を必要とする21。Airyscanに代わるものとして、従来の共焦点顕微鏡が推奨されます。例えば、ナイキスト取得によるイメージング(図3)では、40倍/1.3対物レンズの123.9 nmを使用してピクセルサイズを達成し、脊椎の形態タイプを区別するのに十分です(図2)。
スパイン密度を決定するには、(1)mCherryやGFPなどの細胞質蛍光タンパク質を使用してアクチン細胞骨格を標識するか、(2)LifeActを使用してアクチン細胞骨格を標識するか、(3)ミリストイル化蛍光タンパク質(MYR::mRubyなど)を使用して原形質膜を標識することが推奨されます(図1B)。比較すると、F-アクチン結合タンパク質ウトロフィンは脊椎密度を低下させ(図1C)、ウトロフィンが過剰発現すると脊椎の形態形成に悪影響を与えることを示しています。
現在のイメージング法は、脊椎の形態を支配する遺伝的変異を特定するのに役立つはずです1,16。DDスパインの形態(すなわち、薄い/キノコ、糸状、ずんぐりした、分岐した、図2を参照)は、ほとんどのDDスパインが特徴的な腹側向きの向きを採用しているため、腹側神経索の外側画像の単一の2D投影から評価できます。これらの比較では、明らかな脊椎の形態型が標識方法の影響を受けているように見えるため、各条件に同じ蛍光マーカーを使用することが不可欠です(例:MYR::mRuby vs.ライフアクト::GFP)。さらに、スパイン形状は動的であり、外部信号に応答して形状が変化する可能性が高いことに留意した2,16。したがって、同様の発生段階および同様の条件下での遺伝子型間で脊椎の形状を比較することも不可欠です。
C.エレガンスの腹側の向きは、正確な画像取得に非常に重要です。動物の反対側の腹側と背側の両方のコードが同じZ平面に見えるはずであり、ワームがその側に向けられていることを示しています(図1B)。腹帯の近くで他の虫や泡と動いたり接触したりする虫の画像は、棘の画像を劣化させる可能性があるため、収集しないことをお勧めします。
in vivoカルシウムイメージングでは、各取得の直前に新鮮なスライドを準備する必要があります。細い接着剤繊維のみと接触しているワームを画像化するのが最善です。ワームを乾燥させ、画像を劣化させる傾向がある接着剤の「塊」(図4B)。図4に示す実験では、561nmの光のパルスが視野全体を活性化します。例えば、個々のDDスパイン内の局所的なCa++過渡現象を検出するために時間的および空間的分解能を増加させるために、561nmレーザーライン用にセットアップされたガルボミニスキャナーを使用して、より小さな関心領域を刺激することができる17。
The authors have nothing to disclose.
Imarisのイメージングと分析は、NIHがサポートするヴァンダービルト細胞イメージング共有リソース(CIRS)で実行されました(CA68485、DK20593、DK58404、DK59637、およびEY08126)。LSM 880 は助成金 1S10OD201630 でサポートされています。ニコンのスピニングディスクでのイメージングは、ニコンセンターオブエクセレンスで行われました。CISRディレクターのジェニー・シェーファーとブライアン・ミリスには、トレーニングと洞察に満ちた議論をしてくれたこと、そしてバーネットラボのメンバーであるディラン・バーネット、エイダン・フェニックス、ニレイ・タネハにアドバイスをいただき、感謝します。この研究は、DMMへの国立衛生研究所の助成金(R01NS081259およびR01NS106951)およびACCへの米国心臓協会の助成金(18PRE33960581)によってサポートされました。
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |