Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징
Summary
수지상 등뼈는 신경계의 중요한 세포 특징입니다. 여기에서는 C. elegans에서 수지상 가시의 구조와 기능을 평가하기위한 라이브 이미징 방법이 설명됩니다. 이러한 접근법은 수지상 척추 모양 또는 기능을 정의하는 유전자에 대한 돌연변이 스크린의 개발을 지원합니다.
Abstract
수지상 가시는 활동에 의해 조절되는 시냅스 신경 분포의 특수 부위이며 학습과 기억을위한 기질 역할을합니다. 최근에, 수지상 척추는 Caenorhabditis elegans의 운동 회로에서 시냅스 전 콜린성 뉴런으로부터의 입력 부위로서 DD GABA 성 뉴런에 대해 설명되었다. 이 시냅스 회로는 이제 C의 손쉬운 유전학과 준비된 접근성을 이용하는 척추 형태 형성 및 기능의 강력한 새로운 생체 내 모델 역할을 할 수 있습니다 . 생세포 이미징에 대한 엘레간스.
이 프로토콜은 DD 척추 구조 및 기능을 평가하기 위한 실험 전략을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 초고해상도 이미징 전략을 사용하여 액틴이 풍부한 수지상 가시의 복잡한 모양을 시각화합니다. DD 척추 기능을 평가하기 위해 광 활성화 옵신 인 Chrimson은 시냅스 전 콜린성 뉴런을 자극하고 칼슘 지표 인 GCaMP는 시냅스 후 DD 척추에서 유발 된 칼슘 과도 상태를보고합니다. 함께, 이러한 방법은 C. elegans 에서 수지상 척추의 유전 적 결정 요인을 식별하기위한 강력한 접근법으로 구성되며, 이는 또한 척추 형태 형성과 뇌의 기능을 지시 할 수 있습니다.
Introduction
수지상 가시는 시냅스 전달을 위해 이웃 뉴런으로부터 입력을받는 특수 세포 구조입니다. 신경 전달 물질 수용체의 활성화는 이러한 특징적인 신경 돌출부에서 세포 내 칼슘 및 하류 신호 전달 경로를 상승시킵니다1. 신경 전달에 대한 수지상 척추의 근본적인 중요성과 신경발달 질환에서 잘못된 조절 1 때문에 수지상 척추 형태 형성 및 기능을 조절하는 요인의 발견은 신경 과학 분야에서 높은 관심을 끌고 있습니다.
최근에, 수지상 가시는 포유류 가시와 공유되는 주요 특성을 기반으로 C. elegans 신경계에서 확인되었습니다2. 이 결정은 척추 생물학을 조사하기 위해 C. elegans의 장점을 활용할 가능성을 열어주기 때문에 중요합니다. 등쪽 D(DD) 운동 뉴런의 수지상 가시는 복부 신경줄의 콜린성 뉴런(VA 및 VB)으로부터 입력을 받습니다(그림 1A)2,3,4. 여기에서는 DD 수지상 가시의 구조와 생체 내 기능을 라이브 이미징 및 유전자 분석에 쉽게 접근할 수 있는 온전한 신경계에서 탐색하기 위한 이미징 방법을 제시합니다. 수지상 가시의 형상을 모니터링하기 위해, (1) 수지상 과정 및 가시를 채우는 세포질 형광 단백질; (2) 수지상 가시와 수상 돌기의 경계를 장식하는 막 결합 형광 단백질; 또는 (3) 수지상 가시가 풍부한 액틴 마커인 LifeAct5 또는 Utrophin6을 사용하여 모양을 드러냅니다. DD 스파인의 기능을 모니터링하기 위해 GCaMP 형광은 시냅스 전 콜린성 뉴런7에서 적색 편이 옵신 크림슨의 활성화에 의해 유발되는 Ca++ 과도 현상을 감지하는 데 사용됩니다. 두 전략 모두 야생형 및 돌연변이 동물에서 DD 수지상 가시에 대한 연구를 용이하게 할 것으로 예상됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Airyscan 검출기는 기존의 컨포칼 현미경19,20보다 더 높은 신호 대 잡음비와 더 나은 해상도를 제공하기 때문에 DD 척추의 스냅샷을 수집하기 위해 선택되었습니다. AiryScan 이미징은 또한 현재 C. elegans에 널리 사용되는 기존의 형광 단백질 (예 : GFP, mCherry 등)의 사용을 허용합니다. 더 높은 해상도의 이미지가 다른 수퍼-해상도 방법(예를 들어, STORM, STED, PALM)으로 획득될 수 있지만, 이들 방법은 광-활성화가능 또는 광-전환가능한 형광 단백질(21)을 필요로 한다. Airyscan의 대안으로 기존의 컨포칼 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 나이퀴스트 획득(그림 3)을 사용한 이미징은 척추 형태학적 유형을 구별하기에 충분한 123.9nm의 40x/1.3 대물렌즈를 사용하여 픽셀 크기를 달성합니다(그림 2).
척추 밀도를 측정하려면 (1) mCherry 또는 GFP와 같은 세포질 형광 단백질을 사용하거나, (2) LifeAct를 사용하여 액틴 세포 골격을 표지하거나, (3) 미리스토일화 형광 단백질(예: MYR::mRuby)을 사용하여 원형질막에 표지하는 것이 좋습니다(그림 1B). 이에 비해 F-액틴 결합 단백질 우트로핀은 척추 밀도를 감소시키며(그림 1C), 이는 우트로핀이 과발현될 때 척추 형태형성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
현재의 이미징 방법은 척추 형태를 지배하는 유전적 변이를 식별하는 데 도움이 될 것입니다1,16. DD 척추 형태(즉, 얇은/버섯, 필로포디얼, 뭉툭한, 분지, 그림 2 참조)는 대부분의 DD 척추가 특징적으로 복부 방향 방향을 채택하기 때문에 복부 신경줄 측면 이미지의 단일 2D 투영에서 평가할 수 있습니다. 이러한 비교에서, 명백한 척추 형태학적 유형이 라벨링 방법의 영향을 받는 것으로 보이기 때문에 각 조건에 대해 동일한 형광 마커를 사용하는 것이 필수적입니다(예: MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). 또한, 척추 형상은 동적이며 외부 신호 2,16에 응답하여 형상이 변할 가능성이 있음에 유의하였다. 따라서 유사한 발달 단계와 유사한 조건에서 유전자형 간의 척추 모양을 비교하는 것도 필수적입니다.
C. elegans 복부 코드의 방향은 정확한 이미지 획득을 위해 매우 중요합니다. 동물의 반대쪽에있는 복부와 등쪽 코드는 모두 동일한 Z 평면에서 볼 수 있어야하며, 이는 웜이 옆으로 향하고 있음을 나타냅니다 (그림 1B). 복부 코드 근처에서 움직이거나 다른 벌레 또는 거품과 접촉하는 벌레의 이미지는 척추의 이미지를 저하시킬 수 있으므로 수집하지 않는 것이 가장 좋습니다.
생체 내 칼슘 이미징의 경우 각 획득 직전에 신선한 슬라이드를 준비해야 합니다. 얇은 접착제 섬유로만 접촉하는 웜을 이미지화하는 것이 가장 좋습니다. 벌레를 건조시키고 이미지를 저하시키는 경향이있는 접착제의 “덩어리”(그림 4B). 그림 4에 표시된 실험에서 561nm 빛의 펄스는 전체 시야를 활성화합니다. 예를 들어, 개별 DD 척추 내에서 로컬 Ca++ 과도 현상을 검출하기 위한 시간적 및 공간적 분해능을 증가시키기 위해, 561nm 레이저 라인에 대해 설정된 갈보 미니 스캐너를 사용하여 더 작은 관심 영역(17)을 자극할 수 있다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaris에 대한 이미징 및 분석은 NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 및 EY08126)가 지원하는 Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS)에서 수행되었습니다. LSM 880은 보조금 1S10OD201630에 의해 지원됩니다. Nikon 회전 디스크에서의 이미징은 Nikon Center of Excellence에서 수행되었습니다. CISR 디렉터 인 Jenny Schafer와 Bryan Millis의 교육 및 통찰력있는 토론과 Burnette 연구소의 구성원 인 Dylan Burnette, Aidan Fenix 및 Nilay Taneja에게 조언을 구해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 DMM에 대한 국립 보건원 보조금 (R01NS081259 및 R01NS106951)과 ACC (18PRE33960581)에 대한 미국 심장 협회 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
Referencias
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma – Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist’s guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
