Summary

用蛋白毒性应激器治疗大 肠杆菌 后蛋白质聚合物的提取和可视化

Published: June 29, 2021
doi:

Summary

本协议描述了用蛋白质毒性抗菌素治疗后从 大肠杆 菌中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。遵循此程序,可以对不同细菌菌株和/或治疗之间的 体内 蛋白质聚合形成进行定性比较。

Abstract

生物体暴露于环境和细胞压力中通常会导致蛋白质平衡的破坏,并可能导致蛋白质聚集。细菌细胞中蛋白质聚合物的积累可导致细胞表型行为发生重大变化,包括生长速率、抗应力和毒性降低。对这些压力源介质表型的检查存在几个实验程序。本文描述了一种优化的检测方法,用于使用含银抗菌素治疗后,从不同的 大肠杆 菌菌株中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。众所周知,这种化合物会产生活性氧物种,并导致广泛的蛋白质聚集。

该方法结合了从治疗和未经处理的细胞中分离出的蛋白质聚合物和可溶性蛋白质的离心分离,以及随后通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和库马西染色进行分离和可视化。这种方法简单、快速,允许对不同 大肠杆菌 株中的蛋白质聚合形成进行定性比较。该方法具有广泛的应用,包括研究其他蛋白质抗菌素对多种细菌 体内 蛋白质聚合的影响的可能性。此外,该协议可用于识别有助于增强对蛋白毒物质抵抗力的基因。凝胶带可用于后续识别特别容易聚集的蛋白质。

Introduction

细菌不可避免地会受到无数的环境压力,包括低pH值(例如, 在哺乳动物胃)1,2,活性氧和氯物种(ROS/RCS)(例如,在噬菌细胞氧化爆裂期间)3,4,5,温度升高(如在温泉或热休克期间)6,7,和几个有效的抗菌剂(例如,AGXX用于本协议)8。蛋白质特别容易受到这些压力源的影响,暴露会引发蛋白质的无/误折叠,然后播种聚合。所有生物体都采用保护系统,使它们能够处理蛋白质误折叠9。然而,严重的压力会压倒蛋白质质量控制机制,破坏蛋白质的二级和/或三级结构,最终使蛋白质失活。因此,蛋白质聚合物会严重损害细菌生长和生存、抗压和毒性所需的关键细胞功能。因此,关注蛋白质聚合及其在细菌中的后果的研究是一个相关的课题,因为它对传染病控制的潜在影响。

热诱导蛋白的展开和聚合通常是可逆的7。相比之下,其他蛋白质毒性应激,如氧化应激,可以通过氧化特定的氨基酸侧链导致蛋白质脱/误折叠,并最终导致蛋白质聚合4,从而导致不可逆转的蛋白质改变。压力诱导的不溶性蛋白质聚合物的形成,在分子伴奏及其在酵母和细菌11、12、13中的保护作用的背景下得到了广泛的研究。已经发布了几种协议,利用各种生化技术对不溶性蛋白质聚合物14、15、16、17进行分离和分析。现有协议主要用于研究热休克和/或分子伴郎鉴定后的细菌蛋白聚合。虽然这些协议肯定是该领域的一个进步,但在实验程序中存在一些重大不便,因为它们需要(i)高达 10 L14、17、(ii)复杂的物理干扰过程,包括使用细胞干扰器、法国印刷机和/或声波14、15、17(iii)耗时的重复 洗涤和孵化步骤15,16,17。

本文描述了一个经过修改的协议,旨在解决以前方法的局限性,并允许分析在治疗后与蛋白毒抗菌表面涂层在两种不同的Escherichia大肠杆菌菌株中形成的蛋白质聚合量。涂层由金属银(Ag)和鲁西尼(鲁)组成,以抗坏血酸为条件,其抗菌活性是通过产生活性氧物种8、18来实现的。以下是细菌培养物与抗菌化合物治疗后的准备的详细描述,以及两种大肠杆菌菌株暴露后蛋白质聚集状态的比较,这些菌株具有明显的易感性,可增加抗菌素的浓度。所述方法价格低廉、速度快且可重复,可用于研究其他蛋白质化合物中的蛋白质聚合。此外,可以修改协议,以分析特定基因缺失对各种不同细菌中的蛋白质聚合的影响。

Protocol

1. 大肠杆菌 株MG1655和CFT073应激处理 接种5mL的利生肉汤(LB)介质,分别与单菌群的共生 大肠杆菌 株MG1655和尿病原性 大肠杆菌 (UPEC)菌株CFT073,并在37°C和300 rpm孵育为14-16小时(过夜)。注: 大肠杆菌 CFT073是一种人类病原体。CFT073 的处理必须在生物安全 2 级认证实验室中采取适当的生物安全措施。 将每个菌株稀释成500 mL烧瓶,含有70 mL的3-(N-</e…

Representative Results

图6:大肠杆菌株MG1655和UGEC菌株CFT073中抗菌诱导蛋白聚合的代表性结果。大肠杆菌株MG1655和CFT073生长在37°C和300 rpm至OD600= 0.5-0.55在MOPS-g介质之前,他们处理与指示浓度 (-, 0毫克/毫升;+,175毫克/毫升;+,200毫克/毫升)的抗菌剂45分钟。可溶…

Discussion

本协议描述了一种优化的方法,用于分析蛋白质聚合形成后,处理不同的大肠杆菌菌株与蛋白质毒性抗菌剂。该协议允许同时从经过治疗和未经治疗的大肠杆菌细胞中提取不溶性和可溶性蛋白质分数。与现有的蛋白质聚合分离方案相比,从细胞14,15,16,20,这种方法有几个优点:(?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了伊利诺伊州立大学生物科学学院启动基金、伊利诺伊州立大学新学院倡议赠款和NIAID赠款R15AI164585(J.-U.)的支持。D.).G.M.A.得到了伊利诺伊州立大学本科研究支持计划(对G.M.A.)的支持。K. P. H. 得到了德国学术交流服务局 (DAAD) 提供的 RISE 研究金的支持。作者感谢来自大科技维特里布斯有限公司的乌韦·兰道博士和卡斯滕·迈耶博士提供了AGXX粉末。图1、图2、图3、图4图5是用生物扳机生成的。

Materials

Chemicals/Reagents
Acetone Fisher Scientific 67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 Bio-Rad 1610156
Ammonium persulfate Millipore Sigma A3678-100G
Benzonase nuclease Sigma E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa GoldBio P008-500
β-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-100ML
Bromophenol blue GoldBio B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250 MP Biomedicals LLC 821616
D-Glucose Millipore Sigma G8270-1KG
D-Sucrose Acros Organics 57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich SLBT9686
Glacial Acetic acid Millipore Sigma ARK2183-1L
Glycerol, 99% Sigma-Aldrich G5516-1L
Glycine GoldBio G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol) Sigma 402893-2.5L
LB broth (Miller) Millipore Sigma L3522-1KG
LB broth with agar (Miller) Millipore Sigma L2897-1KG
Lysozyme GoldBio L-040-25
10x MOPS Buffer Teknova M2101
Nonidet P-40 Thomas Scientific 9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic Sigma-Aldrich P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic Acros Organics 7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Millipore Sigma T9281-50ML
Thiamine Sigma-Aldrich T4625-100G
100% Trichloroacetic acid Millipore Sigma T6399-100G
Tris base GoldBio T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL) Alkali Scientific JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL) Carolina 726686
Erlenmeyer flask (500 mL) Carolina 726694
Freezer: -80 °C Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm) BioSpec Products 1107-9105
Microcentrifuge Hermle Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL) VWR International 87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL) Axygen Maxiclear Microtubes MCT-200-C
Plastic cuvettes Fischer Scientific 14-377-012
Power supply ThermoFisher Scientific EC105
Rocker Alkali Scientific RS7235
Shaking incubator (37 °C) Benchmark Scientific
Small glass plate Bio-Rad 1653311
Spacer plates (1 mm) Bio-Rad 1653308
Spectrophotometer Thermoscientific 3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber Bio-Rad 1658004
Vortexer Fisher Vortex Genie 2 12-812
Thermomixer Benchmark Scientific H5000-HC
10 well comb Bio-Rad 1653359

Referencias

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Sultana, S., Anderson, G. M., Hoffmann, K. P., Dahl, J. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. Exp. (172), e62628, doi:10.3791/62628 (2021).

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