מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למדידת איזולבוגלנדינים ברקמות על ידי אימונופלואורסנציה באמצעות נוגדן ScFv D11 מצומד אלקליין פוספטאז. מודלים של יתר לחץ דם הן בעכברים והן בבני אדם משמשים כדי להסביר את ההליכים שלב אחר שלב ואת עקרונות היסוד הקשורים למדידת איזולבוגלנדין בדגימות רקמות.
איזולבוגלנדינים (IsoLGs) הם גמא קטואלדהידים תגובתיים מאוד הנוצרים מאיזופרוסטנים H2 דרך חמצון שומנים וחלבונים צולבים המובילים לדלקת ולמחלות שונות, כולל יתר לחץ דם. איתור הצטברות IsoLG ברקמות הוא קריטי כדי לשפוך אור על מעורבותן בתהליכי המחלה. עם זאת, מדידת IsoLGs ברקמות היא קשה ביותר, והכלים הזמינים כיום, כולל ניתוח ספקטרומטריית מסות, הם מייגעים ויקרים מאוד. כאן אנו מתארים שיטה חדשנית לזיהוי באתרו של IsoLGs ברקמות באמצעות D11 ScFv מצומד אלקליין פוספטאז ונוגדן תצוגת פאגים רקומביננטי המיוצר ב- E. coli במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי. ארבעה פקדים שימשו לאימות הצביעה: (1) צביעה עם ובלי D11, (2) צביעה עם תמצית פריפלסמית חיידקית עם מקשר phosphatase אלקליין, (3) צביעת נוגדנים scFV לא רלוונטי, ו (4) בקרה תחרותית עם IsoLG לפני הצביעה. אנו מדגימים את היעילות של D11 מצומד פוספטאז אלקליין הן ברקמות אנושיות והן ברקמות עכבר עם או בלי יתר לחץ דם. שיטה זו תשמש ככל הנראה ככלי חשוב לחקר תפקידם של IsoLGs במגוון רחב של תהליכי מחלה.
איזולבוגלנדינים (IsoLGs), הידועים גם בשם איזוקטלים, הם איזומרים ממשפחת 4-קטואלדהידים, שהם תוצרים של חמצון שומנים, ומגיבים עם אמינים ראשוניים על חלבונים 1,2. IsoLGs היו מעורבים במספר מחלות, כולל לב וכלי דם, אלצהיימר, מחלות ריאה וכבד, וסוגים רבים של סרטן3. IsoLGs נחקרו באופן הנרחב ביותר בתרומתם למחלות לב וכלי דם (CVD), המהוות נטל בריאותי וכלכלי משמעותי ברחבי העולם, כולל ארצות הברית. ההערכה היא כי 92.1 מיליון מבוגרים בארה”ב יש לפחות סוג אחד של CVD, עם תחזיות מוערך 2030 להגיע ל 43.9% מהאוכלוסייה הבוגרת בארה”ב4. הורדת לחץ הדם, כולסטרול והפסקת עישון מפחיתה את הסיכון הכולל להתרחשות אירועי CVD5.
לחץ דם גבוה או יתר לחץ דם הוא גורם סיכון מרכזי למחלות לב וכלי דם ומשפיע על כמחצית מאוכלוסיית ארה”ב6. מחקרים קודמים מצאו כי דלקת היא הגורם הבסיסי ליתר לחץ דם וכי IsoLGs ממלאים תפקיד7. גירויים יתר לחץ דם, כולל אנגיוטנסין II, קטכולאמינים, אלדוסטרון ועודף מלח תזונתי, גורמים להצטברות IsoLG בתאים מציגי אנטיגן כולל תאים דנדריטיים (DCs), אשר בתורם מפעילים תאי T כדי להתרבות ולייצר ציטוקינים דלקתיים התורמים ליתר לחץ דם 8,9.
בעבר, IsoLGs נמדדו על ידי אימונוהיסטוכימיה, ספקטרומטריית מסות, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים וציטומטריית זרימה10,11. כדי להקל על המדידה של IsoLGs, נוגדן רקומביננטי בעל שרשרת אחת (scfv) (D11) פותח כנגד IsoLGs12. בתחילה, נוגדן D11 זה הכיל תג E של 11 חומצות אמינו ודרש נוגדן משני לזיהוי אימונוהיסטוכימיה11. עם זאת, היה קשה למצוא נוגדן משני אמין נגד תג E לאחר הפסקת הייצור שלה על ידי היצרן. לכן, פיתחנו פרוטוקול אמין לצביעה אימונופלואורסצנטית של IsoLGs באמצעות D11 מצומד עם phosphatase אלקליין (D11-AP), אשר הדגמנו ברקמות עכבר ואדם עם וללא יתר לחץ דם.
D11 נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים המובלים ב-IsoLG בתאים או ברקמות כסמן לדלקת או לעקה חמצונית במחלות 8,9,20. בעבר, D11 הכיל תג E ופיתוח IHC דרש שימוש בנוגדן משני נגד תג E מצומד עם HRP10,20,21. כאן, פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לזיהוי חלבונים המודבקים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E, אשר מבטל את הצורך בדגירה משנית של נוגדנים.
כדי לקבוע את הספציפיות של D11-AP, בוצעו ארבעה ניסויי בקרה שליליים. ביצענו את הפרוטוקול ללא נוכחות של D11 והיה לנו פיתוח מינימלי. לתוצאות אלה יש אינדיקציה כפולה: פוספטאז אלקליין אנדוגני אינו תורם לפיתוח, והכתמים שנצפו נובעים מ- D11 ולא מגורם תורם אחר. לאחר מכן, צבענו שקופיות עם מקשר AP ללא D11. ניסוי זה הביא לכתמים מועטים, מה שמצביע על כך ש-AP חופשי או גורמים אחרים בתמצית הפריפלסמית אינם גורמים לכתם שאנו רואים בנוכחות D11. כדי להבטיח את הספציפיות של D11 ל-IsoLG, דגרנו מראש על D11-AP עם IsoLG מטוהר לפני צביעת שקופיות. ראינו ירידה בפיתוח אשר מצביעה על כך ש-D11-AP היה קשור לחלבון IsoLG, ובכך מיצה את כמות D11-AP החופשי להיקשר ל-IsoLG הקיים ברקמה. לבסוף, כדי להבטיח ש-D11-AP נקשר ל-IsoLG ולא לחלבון MSA ש-IsoLG היה קשור אליו, דגרנו מראש על D11-AP עם MSA בלבד. לא היו שינויים בפיתוח, מה שמצביע על כך ש-D11-AP לא נקשר ל-MSA אלא לחלבון IsoLG. לבסוף, חוקרים שפיתחו את פרוטוקול הצביעה היו עיוורים למצב יתר לחץ דם של רקמת מעיים אנושית. ההבדלים בכתמים שנצפו בין חולים עם יתר לחץ דם לחולים עם נורמיתר לחץ דם לא נבעו מהטיה ותוארו בעבר22,23.
למרות שהפרוטוקול שלנו לזיהוי חלבונים המובלים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E הוא קפדני וחזק ומבטל את הצורך בדגירה משנית של נוגדנים, יש לו כמה מגבלות. מגבלה אחת היא שהשתמשנו ב-D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין בתמצית הפריפלסמית, וייתכן שיש צביעה כוזבת של פוספטאז אלקליין אנדוגני בתמצית הפריפלסמית או ברקמות מסוימות, כגון מעי24. עם זאת, הצעד הראשון לפיתוח פרוטוקול זה כלל השבתת phosphatase אלקליין אנדוגני שעשוי להיות נוכח ברקמות25. בתחילה, חומצה אצטית קרה, BME, ו Levamisole26 נבדקו עבור יעילות. אף אחד מאלה לא הפחית לחלוטין את נוכחותו של פוספטאז אלקליין אנדוגני פעיל. חום שימש כדי להשבית phosphatase אלקליין27, ולכן בדקנו נטרול חום של phosphatase אלקליין במאגרים שונים. מצאנו שמגלשות חימום ולחות בחיץ ציטראט ביטלו את רוב הפופטאז אלקליין אנדוגני. שקופיות פותחו בתחילה באמצעות מצע כימילומינסנט/פלואורסצנטי, אך כאשר צולמו ללא מצע זה, הייתה כמות גבוהה של אוטופלואורסצנטיות. VectorRed הוא מצע אשר מתפתח בנוכחות phosphatase אלקליין לייצר כרומוגן, אשר ניתן לדמיין בטווח ערוצי טקסס אדום / TRITC. באמצעות מצע זה, הצלחנו לצפות בקלות רבה יותר באות מעל אוטופלואורסצנטיות ברקע. יש להקפיד במהלך תהליך הצביעה כדי למזער כתמים מלאכותיים. ייבוש רקמות בשקופיות לאחר הידרציה עד להדמיה הביא להתפתחות מוגברת. D11-AP צריך להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C. יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים בעת עבודה עם D11-AP. תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) יכולה גם להשפיע על הפעילות האנזימטית של פוספטאז אלקליין ואין להשתמש בה כחיץ שטיפה28. כמו בכל גישה מבוססת נוגדנים, יש לבצע בדיקות יסודיות ואופטימיזציה כדי להבטיח שהכתמים הם ספציפיים, וכי האות אינו מוגבר או מוגבר.
לסיכום, פיתחנו פרוטוקול ממוטב חזק, קפדני וחזק לזיהוי חלבונים המובלים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E. פרוטוקול זה מציג מספר יתרונות: ראשית, השימוש ב- D11 כחלבון היתוך אלקליין פוספטאז זול יותר. D11 נגזר במקור מספריית נוגדני פאגים שלא ניתן היה למסחר והיה יקר לטיהור. למרות D11 בתמצית E. coli periplasmic יכול לספק חלופה זולה, זה לא היה יעיל ברוב הבדיקות. שנית, גישת היתוך phosphatase אלקליין מאפשרת D11 scfv יש כתב שימושי15 (phosphatase אלקליין) מאוחה אליו ולא יהיה צורך לטהר אותו לשימוש immunoassays כמו מצעים זמינים מסחרית. שלישית, E. coli אלקליין phosphatase יוצר דימרים29. אז D11, כאשר מאוחה לפוספטאז אלקליין היה יוצר גם דימרים וזה מגביר את ההתלהבות של הנוגדן ואת פעילות הקישור30. לבסוף, D11 מצומד עם phosphatase אלקליין בתמצית periplasmic ניתן לנקות בקלות באמצעות Cibacron Blue Sepharose. D11 יש נקודה איזואלקטרית גבוהה (~ 9.2 pH). ככזה, הוא טעון חיובי ויכול להיקשר לכחול Cibacron באמצעות אינטראקציות pi-cation. רוב הזיהומים בתמצית E. coli periplasmic ניתן לדלל את השרף. לאחר מכן ניתן לדלל את D11 המצומד עם פוספטאז אלקליין באמצעות מלח גבוה (~1.5M NaCl) במים. D11 מדולל מצומד עם phosphatase אלקליין הוא יציב למדי ב 4-8 ° C בתמיסת מלח גבוהה. לכן, פיתחנו פרוטוקול שלא רק הופך את נוגדן D11 לזמין בעלות נמוכה, אלא גם מבטל את השלבים הנוספים ואת הצורך בדגירה השניונית של הנוגדנים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה ניתנת לשחזור של IsoLGs, המצטברים ברקמות במחלות מרובות שבהן לחץ חמצוני מוגבר משחק תפקיד.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 ו- R03HL155041 ל- A.K. אנו מודים למשאב המשותף להיסטולוגיה דיגיטלית – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 על תצוגה חזותית וסריקת שקופיות.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |