Protokollene som rapporteres her illustrerer tre alternative måter å vurdere ytelsen til genetisk konstruerte mygg som skal til vektorstyring i laboratorieinformive små burforsøk. Hver protokoll er skreddersydd til den spesifikke modifikasjonen myggstammen bærer (gendrift eller ikke-gendrift) og hvilke typer parametere som måles.
Kontroll av myggbårne patogener ved hjelp av genetisk modifiserte vektorer har blitt foreslått som et lovende verktøy for å utfylle konvensjonelle kontrollstrategier. CRISPR-baserte homing gendrivsystemer har gjort transgene teknologier mer tilgjengelige i det vitenskapelige samfunnet. Evaluering av transgen myggytelse og sammenligninger med ville motparter i små laboratorieburforsøk gir verdifulle data for utformingen av påfølgende feltbureksperimenter og eksperimentelle vurderinger for å avgrense strategiene for sykdomsforebygging. Her presenterer vi tre forskjellige protokoller som brukes i laboratoriemiljøer for å evaluere transgene spredning i anopheline myggvektorer av malaria. Disse inkluderer inundative utgivelser (ingen gen-drive system), og gen-drive overlappende og ikke-overlappende generasjonsforsøk. De tre studiene varierer i en rekke parametere og kan tilpasses ønsket eksperimentelle innstillinger. Videre er insektstudier i små bur en del av den progressive overgangen av konstruerte insekter fra laboratoriet til åpne feltutgivelser. Derfor representerer protokollene beskrevet her uvurderlige verktøy for å gi empiriske verdier som til slutt vil hjelpe feltimplementering av ny teknologi for malaria eliminering.
Strategier basert på genetisk konstruerte mygg forfølges for å kontrollere overføring av vektorbårne patogener som de som forårsaker malaria1. Disse inkluderer teknologier 1) rettet mot å redusere antall og tettheter av Anopheles mygg (befolkningsundertrykking), eller 2) med sikte på å svekke vektorens evne til å overføre parasitter som er ansvarlige for menneskelig sykdom (befolkningsmodifisering, erstatning eller endring) der vektorstammer er konstruert for å uttrykke effektorgener som forhindrer patogenoverføring. Disse genetiske tilnærmingene har blitt styrket av fremkomsten av CRISPR / Cas9-baserte genstasjoner, med konseptbevis i parasittoverførings mygg med effektiv spredning av nyttelastegenskaper samt anti-parasittiske effektormolekyler i burpopulasjoner.
Små laboratoriemerdforsøk representerer et første skritt for å evaluere karakteristikken for transgene stammer som en del av en faset tilnærming til deres videre utvikling mot feltapplikasjoner2. Spesifikke utfallshensyn inkluderer arvelighet av det introduserte DNA i et konkurransedyktig miljø, penetrans og uttrykksevne av fenotypen og stabilitet. Relevante eksperimentelle designfunksjoner inkluderer størrelsen på merdene, myggtetthet, antall replikeringer, overlappende eller ikke-overlappende generasjoner, aldersstrukturerte målpopulasjoner, enkelt- eller flere utgivelser av konstruerte stammer, kun for menn, ren kvinne- eller blandet kjønn-utgivelser, frigjøringsforhold, blodmelkilder (kunstige eller levende dyr) og screeningprosedyrer.
Vi beskriver her protokoller som brukes til å evaluere stammer av anopheline mygg for inundative utgivelser (ingen gen-drive system) og de som bærer autonome gen-drive systemer mediert av Cas9 endonucleases og guide RNAs (gRNA). Anvendelser av disse protokollene vises i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, og Adolfi et al. (2020) 4.
Inundative utgivelsesforsøk evaluerer spredningshastigheten til en designet transgene under Mendelian arv etter flere utgivelser av et stort antall transgene mygg til en vill befolkning. Uten vedlegg av transgene til et drivsystem, gir data fra inundative utgivelsesforsøk informasjon om kondisjon og dynamikk av transgene av interesse i en stabilisert befolkning.
Når myggpopulasjoner inneholder et autonomt gendriftssystem, er små burforsøk designet for å vurdere dynamikken i spredningen av ønsket transgene ved å bestemme graden av dominerende markørøkning etter en enkelt introduksjon av transgene menn. Autonome gen-drivelementer bærer genene som koder Cas9-kjernen, gRNA og dominerende markør knyttet på en slik måte at de er aktive i etterfølgende generasjoner.
“Overlappende” generasjoner refererer til samtidig tilstedeværelse av flere generasjoner i samme bur for å skape en aldersstrukturert kontinuerlig befolkning, mens “ikke-overlappende” refererer til enkelt diskrete generasjoner i hver påfølgende burpopulasjon2. Gene-drive bur eksperimenter kan avsluttes når den første dynamikken i stasjonen (konvertering) hastigheten kan bestemmes (8-10 generasjoner avhengig av konstruksjonen), og mens de gir informasjon om kortsiktig stabilitet av transgene i myggpopulasjonen, kan de ikke avsløre hva som skjer når og hvis de dominerende markørfrekvensene når eller er nær full introduksjon (hver mygg som bærer minst en kopi av gen-stasjonen systemet).
Genetisk konstruerte mygg som har patogenblokkeringsevne eller bjørnsterilitetsgener utgjør nye verktøy for å kontrollere vektorbårne sykdommer. Gitt mangfoldet av parametere som består av disse alternative tilnærmingene, består et kritisk skritt i forskningen deres av laboratoriebegrensede eksperimentelle evalueringer som tillater en rask og sikker prediksjon av de potensielle resultatene av en syntetisk transgenefrigjøring for kontrollformål1.
Fordi overvåkingen av den transgene dynamikken i burpopulasjoner kan strekke seg i flere måneder, er en av de sentrale aspektene ved protokollene konsistensen i eksperimentell design mellom replikering (inkludert myggoppdrett, burstørrelse, aldersstrukturerte populasjoner, faste frigjøringsforhold, stabile blodmelkilder og minimalt invasive screeningprosedyrer).
Mannlige utgivelser anses som ideelle fordi mannlige mygg verken overfører patogener eller spiser på mennesker, derfor kan de trygt introdusere arvelige egenskaper i ville populasjoner. I laboratoriebureksperimenter er det mulig å oppdage transgene stammer med redusert mannlig parring konkurranseevne og andre treningsbelastninger forbundet med transgene integrasjon. Imidlertid kan direkte og spesifikke eksperimenter, som de som utføres i store bur10, utføres for å analysere mannlig konkurranseevne riktig, samt kvinnelig fecundity i mer naturlige myggtettheter2. Videre kan empiriske data fra merdforsøkene brukes til å parameterisere modeller av merdpopulasjonsdynamikk, inkludert resistent alleldannelse, og gi nyttig informasjon om effektivitet og mulige justeringer i den foreslåtte teknologien.
Protokollene beskrevet her kan enkelt tilpasses andre eksperimentelle design etter behov, med minimale krav til vanlig insektinfrastruktur og forhold. I tillegg, bortsett fra de kommersielle merdene og mikroskopene, er de fleste materialene billige og tillater billige flere replikeringer og gjentakelser av forsøkene. Spesielt tillater dette også at flere transgene stammer kan forhåndsscreenes i små burforsøk for å prioritere best presterende kandidater som skal flyttes fremover i faset testvei og å suspendere testing på de som viser sub-optimale forestillinger.
Til slutt motiverer bekymring for bruk av genmodifiserte organismer utarbeidelsen av rammeverk for utvikling, evaluering og anvendelse av genetiske strategier for forebygging av myggbårne sykdommer5,8,9. Relevansen og utførelsen av protokollene som er definert her, er i samsvar med disse retningslinjene.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for mygghold. Finansieringen ble gitt av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.
Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |