여기에서 보고된 프로토콜은 실험실에 포함된 작은 케이지 예심에서 벡터 통제를 위한 유전으로 조작된 모기의 성능을 평가하는 세 가지 대안을 보여줍니다. 각 프로토콜은 모기 균주 곰 (유전자 드라이브 또는 비 유전자 드라이브)과 측정 된 매개 변수의 유형을 특정 수정에 맞게 조정됩니다.
유전자 변형 벡터를 사용하여 모기 매개 병원균의 제어는 기존의 제어 전략을 보완하는 유망한 도구로 제안되었습니다. CRISPR 기반 호밍 유전자 드라이브 시스템은 과학 커뮤니티 내에서 트랜스제닉 기술에 더 쉽게 접근할 수 있게 했습니다. 작은 실험실 케이지 시험에서 형질 전환 모기 성능 및 야생 형 대응과의 비교평가는 질병 예방 전략을 구체화하기 위해 후속 현장 케이지 실험 및 실험 평가의 설계에 대한 귀중한 데이터를 제공합니다. 여기에서, 우리는 말라리아의 opheline 모기 벡터에 있는 간질 퍼짐을 평가하기 위하여 실험실 조정에서 이용된 3개의 다른 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 침수성 방출(유전자 구동 시스템 없음)과 유전자 구동 중복 및 겹치지 않는 생성 시험이 포함됩니다. 세 가지 시험은 여러 매개 변수에서 다르며 원하는 실험 설정에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한, 작은 케이지에 있는 곤충 연구는 실험실에서 개방필드 방출로 엔지니어링곤충의 점진적인 전환의 일부입니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 궁극적으로 말라리아 제거를 위한 새로운 기술의 현장 구현을 돕는 경험적 가치를 제공하는 귀중한 도구를 나타냅니다.
유전자 조작 모기에 근거를 둔 전략은 말라리아를 일으키는 원인이 되는 것과 같은 벡터 부담 병원체의 전송을 통제하기 위하여 추진되고 있습니다1. 여기에는 Anopheles 모기의 수와 밀도(인구 억제) 또는 2) 벡터가 인간 질환(인구 변형, 교체 또는 변경)에 책임이 있는 기생충을 전송하는 능력을 손상시키기 위한 기술 1)이 포함되며, 여기서 벡터의 변종은 병원체 전이를 방지하는 이펙터 유전자를 표현하도록 설계된다. 이러한 유전 적 접근은 CRISPR/ Cas9 기지를 둔 유전자 드라이브의 출현에 의해 강화되었습니다, 파수량 특성의 효과적인 퍼짐의 기생충 전송 모기에 있는 개념증명 및 케이지된 인구에 있는 항 기생 효과기 분자.
작은 실험실 케이지 시험은 필드 응용 프로그램에 대한 추가 개발에 대한 단계적 접근의 일환으로 형질 전환균의 특성을 평가하기위한 첫 번째 단계를 나타냅니다2. 특정 결과 고려 사항에는 경쟁 환경에서 도입 된 DNA의 발성 성, 표현형의 침투 및 표현성 및 안정성이 포함됩니다. 관련 실험 설계 기능에는 케이지의 크기, 모기 밀도, 복제 수, 겹치거나 겹치지 않는 세대, 연령 구조적 대상 인구, 엔지니어링 균주, 남성 전용, 여성 전용 또는 혼합 성 방출, 방출 비율, 혈액 식사 소스 (인공 또는 살아있는 동물) 및 스크리닝 절차가 포함됩니다.
우리는 여기에 undative 방출 (유전자 구동 시스템 없음)에 대한 아노페린 모기의 균주를 평가하는 데 사용되는 프로토콜과 Cas9 엔도니슬리스와 가이드 RNA (gRNA)에 의해 매개 된 자율 유전자 구동 시스템을 운반하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜의 응용 프로그램은 Pham 외에 나타납니다 . (2019) 2, 카르발라 르자라수 외. (2020) 3, 아돌피 외. (2020) 4.
무수한 방출 예심은 야생 인구로 많은 수의 형질 전환 모기의 다중 방출에 따라 Mendelian 상속의 밑에 디자인된 전환유전자의 퍼지는 비율을 평가합니다. 드라이브 시스템에 전유전자를 부착하지 않고, 무수성 방출 시험의 데이터는 안정된 인구에 대한 관심의 전환유전자의 적합성 및 역학에 관한 정보를 제공한다.
모기 집단이 자율적인 유전자 구동 시스템을 포함하는 때, 작은 케이지 예심은 형질전환 수컷의 단 하나 소개 에 따라 지배적인 마커 증가의 비율을 결정함으로써 원하는 전환유전자의 퍼짐의 역학을 평가하기 위하여 디자인됩니다. 자율 유전자 구동 원소는 후속 세대에서 활성화될 수 있도록 Cas9 뉴클레아제, gRNA 및 지배적인 마커를 코딩하는 유전자를 운반한다.
‘겹치는’ 세대는 같은 케이지에 여러 세대가 동시에 존재하여 연령 구조의 연속 인구를 생성하는 반면, ‘겹치지 않는’은 각 연속 케이지 집단2에서 단일 이산 세대를 의미합니다. 유전자 구동 케이지 실험은 드라이브(변환) 속도의 초기 역학이 결정될 수 있고(구조에 따라 8-10세대)를 결정할 수 있고, 모기 집단 내의 트랜스진의 단기 안정성에 대한 정보를 제공하지만, 지배적인 마커 주파수가 도달하거나 완전한 도입에 가까워지거나 완전한 도입에 가까워지면 어떤 일이 일어나는지 밝히지 못할 수 있다(유전자 구동 시스템의 적어도 하나 이하의 모기를 운반하는 모든 모기).
병원균 차단 능력이 있거나 불임 유전자를 견딜 수 있는 유전자 조작 모기는 벡터 매개 질병을 제어하는 새로운 도구를 구성합니다. 이러한 대체 접근법을 구성하는 매개 변수의 복합성을 감안할 때, 그들의 연구에서 중요한 단계는 대조목적을 위해 합성 유전자 방출의 잠재적 결과에 빠르고 안전한 예측을 허용하는 실험실 에 국한된 실험 평가로 이루어져 있습니다1.
케이지 된 인구에서 트랜스 진 역학의 모니터링은 몇 달 동안 연장 할 수 있기 때문에, 프로토콜의 중심 측면 중 하나는 복제 사이의 실험 설계의 일관성입니다 (모기 사육, 케이지 크기, 연령 구조 인구, 고정 방출 비율, 안정적인 혈액 식사 소스 및 최소 침습 적 선별 절차 포함).
남성 전용 방출은 남성 모기가 병원균을 전송하거나 인간에게 먹이지 못하기 때문에 이상적인 것으로 간주되므로 야생 인구에 헤아링 가능한 특성을 안전하게 도입 할 수 있습니다. 실험실 케이지 실험에서, 그것은 감소 남성 짝짓기 경쟁력 및 트랜스 유전자 통합과 관련된 다른 피트 니스 부하와 형질 균주를 감지 할 수있다. 그러나, 대형 케이지10에서 실시된 것과 같은 직접적이고 구체적인 실험은 남성의 경쟁력을 적절히 분석하기 위해 수행될 수 있을 뿐만 아니라, 여성의 특성을 보다 자연적인 모기 밀도2에서 적절히 분석할 수 있다2. 또한 케이지 시험의 경험적 데이터를 사용하여 내성 알렐 형성을 포함한 케이지 인구 역학 모델을 매개변수화하고 제안된 기술의 효과및 가능한 조정에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 정기적인 곤충 인프라 및 조건에 대한 최소한의 요구 사항과 함께 필요에 따라 다른 실험 설계에 쉽게 적응할 수 있습니다. 또한, 상업용 케이지 및 현미경을 제외하고 대부분의 재료는 저렴하며 저비용 다중 복제 및 시험 반복을 허용합니다. 특히, 이것은 또한 다중 형질 전환균이 단계적 시험 경로에서 앞으로 이동하는 최고 성능의 응시자의 우선 순위를 지정하고 최적 성능이 없는 그에 대한 테스트를 중단하기 위해 작은 케이지 시험에서 사전 심사할 수 있게 합니다.
마지막으로, 유전자 변형 유기체의 사용에 관한 관심사는 모기 매개 질병의 예방을 위한 유전 전략의 개발, 평가 및 적용을 위한 프레임워크의 정교화를 동기를 부여합니다5,8,9. 여기에 정의된 프로토콜의 관련성 및 실행은 이러한 지침과 일치합니다.
The authors have nothing to disclose.
드루실라 스틸링거, 키오나 파커, 패리시 파월, 매들린 노톨리에게 모기 축산에 감사드립니다. 기금은 캘리포니아 어바인 말라리아 이니셔티브의 대학에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.
Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |