Protokollerne rapporteret her illustrerer tre alternative måder at vurdere udførelsen af genetisk manipulerede myg bestemt til vektorkontrol i laboratorie-indeholdte små bur forsøg. Hver protokol er skræddersyet til den specifikke ændring mygstamme bjørne (gendrev eller ikke-gendrev) og de typer af parametre målt.
Kontrol med myggebårne patogener ved hjælp af genetisk modificerede vektorer er blevet foreslået som et lovende redskab til at supplere konventionelle kontrolstrategier. CRISPR-baserede sporingsgendrevsystemer har gjort transgene teknologier mere tilgængelige inden for det videnskabelige samfund. Evaluering af transgene myg ydeevne og sammenligninger med vilde-type kolleger i små laboratoriebur forsøg giver værdifulde data til udformningen af efterfølgende felt bur eksperimenter og eksperimentelle vurderinger for at forfine strategier for sygdomsforebyggelse. Her præsenterer vi tre forskellige protokoller, der anvendes i laboratoriemiljøer til at evaluere transgene spredning i anopheline myg vektorer af malaria. Disse omfatter oversvømmelsesfrigivelser (intet gendrevsystem) og gendrev overlappende og ikke-overlappende generationsforsøg. De tre forsøg varierer på en række parametre og kan tilpasses de ønskede eksperimentelle indstillinger. Desuden er insektundersøgelser i små bure en del af den gradvise overgang af manipulerede insekter fra laboratoriet til åbne feltudslip. Derfor repræsenterer de protokoller, der er beskrevet her, uvurderlige værktøjer til at tilvejebringe empiriske værdier, der i sidste ende vil hjælpe med gennemførelsen af nye teknologier til udryddelse af malaria.
Strategier baseret på genetisk manipulerede myg forfølges for at kontrollere overførsel af vektorbårne patogener som dem, der forårsager malaria1. Disse omfatter teknologier 1), der har til formål at reducere antallet og tæthederne af Anopheles myg (befolkning undertrykkelse), eller 2) med henblik på at forringe evnen af vektorer til at overføre parasitter ansvarlig for menneskers sygdom (befolkning modifikation, udskiftning, eller ændring), hvori stammer af vektorer er manipuleret til at udtrykke effektor gener, der forhindrer patogen transmission. Disse genetiske tilgange er blevet styrket af fremkomsten af CRISPR / Cas9-baserede gendrev, med proofs-of-concept i parasit-transmitterende myg af effektiv spredning af nyttelast træk samt anti-parasitiske effektor molekyler i bur populationer.
Små laboratorieburforsøg er et første skridt til evaluering af de karakteristiske træk ved transgene stammer som led i en trinvis tilgang til deres videre udvikling i retning af feltanvendelser2. Specifikke resultatovervejelser omfatter arvelighed af det indførte DNA i et konkurrencepræget miljø, penetrance og ekspressivitet af fænotypen og stabilitet. Relevante eksperimentelle designfunktioner omfatter burenes størrelse, myggetætheder, antal gentagelser, overlappende eller ikke-overlappende generationer, aldersstrukturerede målpopulationer, enkelt- eller flere udslip af manipulerede stammer, kun for mænd, udslip af kvinder eller blandet køn, frigivelsesforhold, blodmelkilder (kunstige eller levende dyr) og screeningsprocedurer.
Vi beskriver her protokoller, der anvendes til at evaluere stammer af anopheline myg for oversvømmelsesfrigivelser (ingen gendrev system) og dem, der bærer autonome gen-drev systemer medieret af Cas9 endonucleaser og guide RNA (gRNA). Anvendelsen af disse protokoller findes i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, og Adolfi et al. (2020) 4.
Oversvømmelsesfrigivelsesforsøg evaluerer spredningshastigheden af en designet transgene under mendelian arv efter flere udgivelser af et stort antal transgene myg til en vild befolkning. Uden fastgørelse af transgene til et drevsystem giver data fra oversvømmelsesfrigivelsesforsøg oplysninger om egnetheden og dynamikken i transgene af interesse i en stabiliseret befolkning.
Når mygpopulationer indeholder et autonomt gendrevsystem, er små burforsøg designet til at vurdere dynamikken i spredningen af den ønskede transgene ved at bestemme hastigheden af dominerende markørforøgelse efter en enkelt introduktion af transgene mænd. Autonome gendrevselementer bærer de gener, der vedkodning af Cas9-nuklease, gRNA og dominerende markør, der er forbundet på en sådan måde, at de er aktive i de efterfølgende generationer.
»Overlappende« generationer henviser til den samtidige tilstedeværelse af flere generationer i samme bur for at skabe en aldersstruktureret kontinuerlig befolkning, mens “ikke-overlappende” henviser til enkelte diskrete generationer i hver af de på hinanden følgende burpopulationer2. Gendrevburforsøg kan afsluttes, når den oprindelige dynamik i drevhastigheden (konverteringsfrekvensen) kan bestemmes (8-10 generationer afhængigt af konstruktionen), og mens de giver oplysninger om transgenenes kortsigtede stabilitet i mygpopulationen, kan de ikke afsløre, hvad der sker, når og hvis de dominerende markørfrekvenser når eller er tæt på fuld introduktion (hver myg, der bærer mindst en kopi af gendrevsystemet).
Genetisk manipulerede myg, der har patogenblokerende evne eller bærer sterilitetsgener, udgør nye værktøjer til at kontrollere vektorbårne sygdomme. I betragtning af de mange parametre, der omfatter disse alternative tilgange, består et kritisk skridt i deres forskning af laboratoriebegrænsede eksperimentelle evalueringer, der giver mulighed for en hurtig og sikker forudsigelse af de potentielle resultater af en syntetisk transgenefrigivelse til kontrolformål1.
Fordi overvågningen af transgene dynamik i bur populationer kan strække sig i flere måneder, en af de centrale aspekter af protokollerne er konsistensen i eksperimentelle design mellem replikater (herunder myg opdræt, bur størrelse, aldersstrukturerede befolkninger, faste frigivelse nøgletal, stabile blodmel kilder og minimalt invasive screening procedurer).
Han-only udgivelser betragtes som ideelle, fordi mandlige myg hverken overfører patogener eller fodrer på mennesker, derfor kan de sikkert introducere arvelige egenskaber i vilde populationer. I laboratorieburforsøg er det muligt at opdage transgene stammer med nedsat mandlig parrings konkurrenceevne og andre fitnessbelastninger forbundet med transgeneintegration. Men direkte og specifikke eksperimenter, som dem, der udføres i store bure10, kan udføres for korrekt at analysere mandlige konkurrenceevne, samt kvindelige fecundity i mere naturlige myg tætheder2. Desuden kan empiriske data fra burforsøgene bruges til at parameterisere modeller af burpopulationsdynamik, herunder resistent alleldannelse, og give nyttige oplysninger om effektivitet og mulige justeringer i den foreslåede teknologi.
De protokoller, der er beskrevet her, kan nemt tilpasses andre eksperimentelle designs efter behov med minimale krav til regelmæssig insektinfrastruktur og forhold. Hertil kommer, bortset fra de kommercielle bure og mikroskoper, de fleste af materialerne er billige og tillader billige flere gentagelser og gentagelser af forsøgene. Dette gør det især også muligt at forhåndsscreene flere transgene stammer i små burforsøg for at prioritere de bedst præsterende kandidater, der skal fremmes i den trinvise testvej, og for at suspendere testning af dem, der viser suboptimale præstationer.
Endelig er bekymring over anvendelsen af genetisk modificerede organismer motiverer udarbejdelsen af rammer for udvikling, evaluering og anvendelse af genetiske strategier til forebyggelse af mygbårne sygdomme5,8,9. Relevansen og udførelsen af de protokoller, der er defineret her, er i overensstemmelse med disse retningslinjer.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for myg opdræt. Finansieringen blev ydet af University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.
Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |