تنميط المركبات المتطايرة في فاكهة الكشمش الأسود باستخدام الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي
Summary
يتم وصف منصة استخراج الغاز والكروماتوغرافيا ذات الطور الصلب في مساحة الرأس هنا لتحديد وقياس كمية متطايرة سريعة وموثوقة وشبه آلية في ثمار الكشمش الأسود الناضجة. يمكن استخدام هذه التقنية لزيادة المعرفة حول رائحة الفاكهة واختيار الأصناف ذات النكهة المحسنة لغرض التربية.
Abstract
هناك اهتمام متزايد بقياس المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) المنبعثة من الثمار الناضجة لغرض تربية الأصناف أو الأصناف ذات الخصائص الحسية المحسنة وبالتالي زيادة قبول المستهلك. تم مؤخرا تطوير منصات استقلابية عالية الإنتاجية لتحديد مجموعة واسعة من المستقلبات في الأنسجة النباتية المختلفة ، بما في ذلك المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة وجودة الرائحة (volatilomics). يتم وصف طريقة تستخدم الاستخراج المجهري للطور الصلب (HS-SPME) إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز – قياس الطيف الكتلي (GC-MS) هنا لتحديد وقياس كمية المركبات العضوية المتطايرة المنبعثة من ثمار الكشمش الأسود الناضجة ، وهو توت يحظى بتقدير كبير لنكهته وفوائده الصحية.
تم حصاد الثمار الناضجة لنباتات الكشمش الأسود (Ribes nigrum) وتجميدها مباشرة في النيتروجين السائل. بعد تجانس الأنسجة لإنتاج مسحوق ناعم ، تم إذابة العينات وخلطها على الفور بمحلول كلوريد الصوديوم. بعد الطرد المركزي ، تم نقل المادة الفائقة إلى قارورة زجاجية في مساحة الرأس تحتوي على كلوريد الصوديوم. ثم تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة باستخدام ألياف الاستخراج المجهري للطور الصلب (SPME) وكروماتوغراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم إجراء القياس الكمي المتطاير على الكروماتوجرامات الأيونية الناتجة عن طريق دمج منطقة الذروة ، باستخدام أيون m / z محدد لكل VOC. تم تأكيد التعليق التوضيحي الصحيح للمركبات العضوية المتطايرة من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ وأطياف الكتلة للمعايير التجارية البحتة التي تعمل في ظل نفس ظروف العينات. تم تحديد أكثر من 60 مركبات عضوية متطايرة في ثمار الكشمش الأسود الناضجة المزروعة في مواقع أوروبية متناقضة. من بين المركبات العضوية المتطايرة المحددة ، يمكن استخدام مركبات الرائحة الرئيسية ، مثل التربينويدات والمتطايرة C6 ، كمؤشرات حيوية لجودة فاكهة الكشمش الأسود. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب الطريقة ، بما في ذلك التحسينات المحتملة. وعلاوة على ذلك، تم التشديد على استخدام الضوابط لتصحيح الدفعات والتقليل إلى أدنى حد من شدة الانجراف.
Introduction
النكهة هي سمة جودة أساسية لأي فاكهة ، مما يؤثر على قبول المستهلك وبالتالي يؤثر بشكل كبير على قابلية التسويق. يتضمن إدراك النكهة مزيجا من أنظمة الذوق والشم ويعتمد كيميائيا على وجود وتركيز مجموعة واسعة من المركبات التي تتراكم في أجزاء نباتية صالحة للأكل ، أو في حالة المركبات العضوية المتطايرة ، تنبعث من الفاكهة الناضجة1,2. في حين ركزت التربية التقليدية على الصفات الزراعية مثل الغلة ومقاومة الآفات، فإن تحسين سمات جودة الفاكهة، بما في ذلك النكهة، قد أهمل منذ فترة طويلة بسبب التعقيد الوراثي وصعوبة النمط الظاهري الصحيح لهذه الخصائص، مما أدى إلى استياء المستهلك3،4. نجحت التطورات الحديثة في منصات الأيض في تحديد وقياس المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة ورائحتها5،6،7،8. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين التنميط الأيضي والأدوات الجينومية أو النسخية يسمح بتوضيح علم الوراثة الكامن وراء نكهة الفاكهة، والتي بدورها ستساعد برامج التربية على تطوير أصناف جديدة ذات خصائص حسية محسنة2،4،9،10،11،12،13،14.
يحظى توت الكشمش الأسود (Ribes nigrum) بتقدير كبير لنكهته وخصائصه الغذائية ، حيث يتم زراعته على نطاق واسع في المناطق المعتدلة في أوروبا وآسيا ونيوزيلندا15. تتم معالجة معظم الإنتاج للمنتجات الغذائية والمشروبات ، والتي تحظى بشعبية كبيرة في بلدان الشمال الأوروبي ، ويرجع ذلك أساسا إلى الخصائص الحسية للتوت. اللون والنكهة المكثفة للفاكهة هي نتيجة لمزيج من الأنثوسيانين والسكريات والأحماض والمركبات العضوية المتطايرة الموجودة في الثمار الناضجة16،17،18. يعود تحليل المواد المتطايرة من الكشمش الأسود إلى 1960s19,20,21. في الآونة الأخيرة ، ركزت العديد من الدراسات على المركبات العضوية المتطايرة الكشمش الأسود ، وتحديد المركبات المهمة لإدراك رائحة الفاكهة وتقييم تأثير النمط الوراثي أو البيئة أو ظروف التخزين والمعالجة على محتوى المركبات العضوية المتطايرة 5،17،18،22،23.
نظرا لمزاياها العديدة ، فإن التقنية المفضلة للتنميط المتطاير عالي الإنتاجية هي HS-SPME / GC-MS24,25. يتم تركيب ألياف السيليكا ، المغلفة بمرحلة بوليمرية ، على جهاز حقنة ، مما يسمح بامتصاص المواد المتطايرة في الألياف حتى يتم الوصول إلى مرحلة التوازن. يحمي استخراج مساحة الرأس الألياف من المركبات غير المتطايرة الموجودة في المصفوفة24. ويمكن ل SPME أن تعزل بنجاح عددا كبيرا من المركبات العضوية المتطايرة الموجودة بتركيزات شديدة التباين (أجزاء في المليار إلى أجزاء في المليون)25. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تقنية خالية من المذيبات تتطلب معالجة عينات محدودة. المزايا الأخرى ل HS-SPME هي سهولة التشغيل الآلي وتكلفته المنخفضة نسبيا.
ومع ذلك ، يمكن أن يكون نجاحها محدودا ، اعتمادا على الطبيعة الكيميائية للمركبات العضوية المتطايرة ، وبروتوكول الاستخراج (بما في ذلك الوقت ودرجة الحرارة وتركيز الملح) ، واستقرار العينة ، وتوافر أنسجة الفاكهة الكافية26,27. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للمركبات العضوية المتطايرة ذات الكشمش الأسود المعزولة بواسطة HS-SPME وتحليلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم تحقيق توازن بين كمية المواد النباتية وثبات العينة ومدة الاستخراج والكروماتوغرافيا لتكون قادرة على معالجة أعداد كبيرة من عينات الكشمش الأسود ، بعضها عرض في هذه الدراسة. وعلى وجه الخصوص، سيتم عرض ومناقشة ملامح المركبات العضوية المتطايرة و/أو كروماتوغرامات خمسة أصناف (“أنديغا” و”بن ترون” و”بن غيرن” و”بن تيران” و”تيهوب”) كمثال على البيانات. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس البروتوكول بنجاح لقياس المركبات العضوية المتطايرة في أنواع أخرى من توت الفاكهة مثل الفراولة (Fragaria x ananassa) ، والتوت (Rubusidaeus) ، والتوت الأزرق (Vaccinium spp).
Protocol
Representative Results
Discussion
لطالما أعيقت تربية رائحة الفاكهة بسبب الوراثة المعقدة والكيمياء الحيوية الكامنة وراء تخليق المركبات المتطايرة ونقص التقنيات اللازمة للتنميط الظاهري الصحيح. ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة في منصات الأيض، جنبا إلى جنب مع الأدوات الجينومية، تسمح أخيرا بتحديد المستقلبات المسؤولة عن تفضيلا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الخدمات المركزية في Apoyo a la Investigación من جامعة ملقة على قياسات HS-SPME/GC-MS. ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التي قدمتها سارة فرنانديز – بالاسيوس كامبوس في القياس الكمي المتقلب. كما نشكر أعضاء كونسورتيوم GoodBerry على توفير مواد الفاكهة.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
Referencias
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
