Profilazione di composti volatili nel frutto del ribes nero utilizzando la microestrazione in fase solida dello spazio di testa accoppiata alla gascromatografia-spettrometria di massa
Summary
Una piattaforma di microestrazione-gascromatografia in fase solida dello spazio di testa è descritta qui per l’identificazione e la quantificazione volatili veloci, affidabili e semi-automatizzate nei frutti di ribes nero maturi. Questa tecnica può essere utilizzata per aumentare la conoscenza dell’aroma della frutta e per selezionare cultivar con sapore migliorato ai fini dell’allevamento.
Abstract
C’è un crescente interesse nella misurazione dei composti organici volatili (COV) emessi dai frutti maturi ai fini dell’allevamento di varietà o cultivar con caratteristiche organolettiche migliorate e, quindi, per aumentare l’accettazione da parte dei consumatori. Recentemente sono state sviluppate piattaforme metabolomiche ad alto rendimento per quantificare una vasta gamma di metaboliti in diversi tessuti vegetali, compresi i composti chiave responsabili del gusto del frutto e della qualità dell’aroma (volatilomica). Un metodo che utilizza la microestrazione in fase solida dello spazio di testa (HS-SPME) accoppiato con gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) è descritto qui per l’identificazione e la quantificazione dei COV emessi dai frutti di ribes nero maturo, una bacca molto apprezzata per il suo sapore e benefici per la salute.
I frutti maturi delle piante di ribes nero (Ribes nigrum) sono stati raccolti e congelati direttamente in azoto liquido. Dopo l’omogeneizzazione dei tessuti per produrre una polvere fine, i campioni sono stati scongelati e immediatamente miscelati con una soluzione di cloruro di sodio. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato trasferito in una fiala di vetro dello spazio di testa contenente cloruro di sodio. I COV sono stati quindi estratti utilizzando una fibra di microestrazione in fase solida (SPME) e un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa a trappola ionica. La quantificazione volatile è stata eseguita sui cromatogrammi ionici risultanti integrando l’area di picco, utilizzando uno specifico ione m/z per ciascun VOC. La corretta annotazione voC è stata confermata confrontando i tempi di ritenzione e gli spettri di massa di standard commerciali puri eseguiti nelle stesse condizioni dei campioni. Più di 60 COV sono stati identificati in frutti di ribes nero maturi coltivati in località europee contrastanti. Tra i COV identificati, i composti aromatici chiave, come terpenoidi e sostanze volatili C6, possono essere utilizzati come biomarcatori per la qualità del frutto del ribes nero. Inoltre, vengono discussi i vantaggi e gli svantaggi del metodo, compresi i potenziali miglioramenti. Inoltre, è stato sottolineato l’uso di controlli per la correzione dei lotti e la minimizzazione dell’intensità della deriva.
Introduction
Il sapore è un tratto di qualità essenziale per qualsiasi frutto, che influisce sull’accettazione da parte dei consumatori e quindi influisce in modo significativo sulla commerciabilità. La percezione del sapore comporta una combinazione del sistema gustativo e olfattivo e dipende chimicamente dalla presenza e dalla concentrazione di una vasta gamma di composti che si accumulano nelle parti commestibili della pianta, o nel caso dei COV, sono emessi dal frutto maturo1,2. Mentre l’allevamento tradizionale si è concentrato su tratti agronomici come la resa e la resistenza ai parassiti, il miglioramento dei tratti della qualità della frutta, incluso il sapore, è stato a lungo trascurato a causa della complessità genetica e della difficoltà di fenotipizzare correttamente queste caratteristiche, portando al malcontento dei consumatori3,4. I recenti progressi nelle piattaforme metabolomiche hanno avuto successo nell’identificare e quantificare i composti chiave responsabili del gusto e dell’aroma dei frutti5,6,7,8. Inoltre, la combinazione del profilo dei metaboliti con strumenti genomici o trascrittomici consente di chiarire la genetica alla base del sapore del frutto, che a sua volta aiuterà i programmi di selezione a sviluppare nuove varietà con caratteristiche organolettiche migliorate2,4,9,10,11,12,13,14.
Le bacche di ribes nero (Ribes nigrum) sono molto apprezzate per il loro sapore e le loro proprietà nutrizionali, essendo ampiamente coltivate nelle zone temperate di Europa, Asia e Nuova Zelanda15. La maggior parte della produzione viene lavorata per prodotti alimentari e bevande, che sono molto popolari nei paesi nordici, principalmente a causa delle proprietà organolettiche delle bacche. Il colore intenso e il sapore del frutto sono il risultato di una combinazione di antociani, zuccheri, acidi e COV presenti nei frutti maturi16,17,18. L’analisi dei volatili del ribes nero risale agli anni 196019,20,21. Più recentemente, diversi studi si sono concentrati sui COV del ribes nero, identificando composti importanti per la percezione dell’aroma di frutta e valutando l’impatto del genotipo, dell’ambiente o delle condizioni di conservazione e lavorazione sul contenuto di VOC5,17,18,22,23.
A causa dei suoi numerosi vantaggi, la tecnica scelta per la profilazione volatile ad alto rendimento è HS-SPME/GC-MS24,25. Una fibra di silice, rivestita con una fase polimerica, è montata su un dispositivo a siringa, consentendo l’adsorbimento delle sostanze volatili nella fibra fino al raggiungimento di una fase di equilibrio. L’estrazione dello spazio di testa protegge la fibra dai composti non volatili presenti nella matrice24. SPME può isolare con successo un elevato numero di COV presenti a concentrazioni altamente variabili (parti per miliardo a parti per milione)25. Inoltre, è una tecnica priva di solventi che richiede un’elaborazione limitata del campione. Altri vantaggi di HS-SPME sono la facilità di automazione e il suo costo relativamente basso.
Tuttavia, il suo successo può essere limitato, a seconda della natura chimica dei COV, del protocollo di estrazione (inclusi tempo, temperatura e concentrazione salina), della stabilità del campione e della disponibilità di sufficiente tessuto frutticolo26,27. Questo documento presenta un protocollo per i COV di ribes nero isolati da HS-SPME e analizzati mediante gascromatografia accoppiato con uno spettrometro di massa a trappola ionica. È stato raggiunto un equilibrio tra la quantità di materiale vegetale, la stabilità del campione e la durata dell’estrazione e della cromatografia per essere in grado di elaborare un numero elevato di campioni di ribes nero, alcuni dei quali presentati in questo studio. In particolare, i profili VOC e/o i cromatogrammi di cinque cultivar (‘Andega’, ‘Ben Tron’, ‘Ben Gairn’, ‘Ben Tirran’, e ‘Tihope’) saranno presentati e discussi come dati di esempio. Inoltre, lo stesso protocollo è stato messo in pratica con successo per la misurazione dei VOC in altre specie di bacche di frutta come la fragola (Fragaria x ananassa), il lampone (Rubusidaeus) e il mirtillo (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’allevamento per l’aroma di frutta è stato a lungo ostacolato dalla complessa genetica e biochimica alla base della sintesi di composti volatili e dalla mancanza di tecnologie per una corretta fenotipizzazione. Tuttavia, i recenti progressi nelle piattaforme metabolomiche, combinati con strumenti genomici, stanno finalmente consentendo l’identificazione dei metaboliti responsabili delle preferenze dei consumatori e di allevare colture con un sapore migliore3. Mentre la maggior parte dei progress…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación dell’Università di Malaga per le misurazioni HS-SPME/GC-MS. Riconosciamo l’assistenza di Sara Fernández-Palacios Campos nella quantificazione volatile. Ringraziamo anche i membri del consorzio GoodBerry per aver fornito il materiale della frutta.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
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