Summary

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Abstract

Ganglioside sind Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie kommen auf allen Wirbeltierzellen und -geweben vor, sind aber im Gehirn besonders häufig. Sie werden hauptsächlich auf dem äußeren Blatt der Plasmamembranen von Zellen exprimiert, modulieren die Aktivitäten von Zelloberflächenproteinen durch laterale Assoziation, fungieren als Rezeptoren in Zell-Zell-Interaktionen und sind Ziele für Krankheitserreger und Toxine. Genetische Dysregulation der Gangliosid-Biosynthese beim Menschen führt zu schweren angeborenen Erkrankungen des Nervensystems. Aufgrund ihrer amphipathischen Natur erfordern die Extraktion, Reinigung und Analyse von Gangliosiden Techniken, die von vielen Forschern in den 80 Jahren seit ihrer Entdeckung optimiert wurden. Hier beschreiben wir Methoden auf Laborebene für die Extraktion, Reinigung und vorläufige qualitative und quantitative Analysen der wichtigsten Ganglioside aus Geweben und Zellen, die in wenigen Stunden abgeschlossen werden können. Wir beschreiben auch Methoden zur großflächigen Isolierung und Reinigung der wichtigsten Gangliosidspezies aus dem Gehirn. Zusammen bieten diese Methoden analytischen und präparativen Zugang zu dieser Klasse bioaktiver Moleküle.

Introduction

Ganglioside sind definiert als Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten1. Sie werden hauptsächlich an der Zelloberfläche exprimiert, wobei ihr hydrophober Ceramidlipidanteil in das äußere Blatt der Plasmamembran eingebettet ist und ihre hydrophilen Glykane sich in den extrazellulären Raum erstrecken2. Obwohl sie in Wirbeltierzellen und -geweben weit verbreitet sind, sind sie besonders häufig im Wirbeltiergehirn3, wo sie zuerst entdeckt und benannt wurden4.

Die Strukturen der Gangliosidglykane variieren und bilden die Grundlage für ihre Nomenklatur (Abbildung 1). Gangliosidglykane bestehen aus einem neutralen Zuckerkern, der unterschiedliche Anzahlen und Verteilungen von Sialinsäuren trägt. Das kleinste Gangliosid, GM4, hat nur zwei Zucker (Sialinsäure, die an Galaktose gebunden ist)5. Größere natürlich vorkommende Ganglioside können weit über ein Dutzend Gesamtzucker enthalten6 oder bis zu sieben Sialinsäuren auf einem einzigen neutralen Kern7. Ihre Ceramidlipidanteile variieren ebenfalls und haben unterschiedliche Sphingosinlängen und eine Vielzahl von Fettsäureamiden. Im Wirbeltiergehirn dominieren vier Gangliosidspezies, GM1, GD1a, GD1b und GT1b. Die Gangliosidexpression ist entwicklungsreguliert, gewebespezifisch und zelltypspezifisch.

Figure 1
Abbildung 1: Wichtige Hirnganglioside und ihre biosynthetischen Vorläufer. Strukturen werden mit der Symbolnomenklatur für Glykane angezeigt11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ganglioside wirken auf molekularer Ebene, indem sie Proteine in ihren eigenen Membranen einbinden und modulieren (cis-Regulation) oder indem sie Glykan-bindende Proteine im extrazellulären Milieu, einschließlich bakterieller Toxine und Lektine auf anderen Zellen (Trans-Erkennung), einsetzen3. Die spezifische Bindung von Gangliosiden an regulatorische Proteine und/oder die Selbstassoziation mit anderen Molekülen zu Lipidflößen führt zu Veränderungen des Zellverhaltens, die sich auf die Struktur und Funktion des Nervensystems, das Fortschreiten von Krebs, den Stoffwechsel, Entzündungen, neuronale Proteinopathien und Infektionskrankheiten auswirken8. Aufgrund ihrer vielfältigen zellulären Rollen können Methoden zu ihrer Isolierung und Analyse verbesserte Einblicke in die Regulation physiologischer und pathologischer Prozesse liefern. Hier werden validierte Methoden für die schnelle Extraktion und Analyse im kleinen Maßstab und die präparative Isolierung von Gangliosiden aus dem Gehirn bereitgestellt. Chancen und Herausforderungen für die Anwendung auf andere Gewebe werden diskutiert.

Protocol

Die Gewebeentnahme erfolgte unter Bedingungen, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt wurden. 1. Grubengangliosidextraktion in kleinem Maßstab und teilweise Reinigung ACHTUNG: Verwenden Sie eine angemessene Belüftung, wenn Sie mit flüchtigen und toxischen Lösungsmitteln arbeiten. Vermeiden Sie durchgehend Plastik; Lösungsmittel extrahieren chemische Komponenten aus vielen Kunststoffen, die nachfolgende Analysen stören. Polytetrafluorethyle…

Representative Results

Die in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden (kleiner Maßstab) liefern Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung der wichtigsten Hirnganglioside. Die Erholung aus dem Gehirn der Maus beträgt ~ 1 μmol Gangliosid pro g Nassgewicht des Gehirns (1 nmol / μL), wenn es wie beschrieben zubereitet wird. Die TLC-Auflösung von 1 μL (1 nmol) unter Verwendung von Abschnitt 3 liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside auf…

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden zur Extraktion und Isolierung von Gangliosid in kleinem und großem Maßstab sind nicht einzigartig – es gibt viele verschiedene Lösungsmittelextraktions- und Reinigungsansätze, die hervorragende Ergebnisse liefern12. Die hier berichteten Methoden zur Reinigung in kleinem Maßstab aus dem Gehirn, von Fredman und Svennerholm13, haben gezeigt, dass sie die Rückgewinnung optimieren und sich über viele Jahre in unserem Labor als robust und un…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience Grant U01CA241953 unterstützt. MJP wurde vom Chemistry-Biology Interface Program an der Johns Hopkins University (T32GM080189) unterstützt.

Materials

Bovine brain, stripped PelFreez 57105-1
Ganglioside standards Matreya GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Glass bottle with PTFE-lined cap Fisher Scientific 02-911-739
Glass centrifuge bottle Fisher Scientific 05-586B
Glass culture tubes, 16 x 125 mm VWR 60825-430 for collecting HPLC fractions
Glass separatory funnel (2 L) Pyrex 6400-2L
Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl Hamilton 81265
p-Anisaldehyde, 98% Sigma-Aldrich  A88107
Potter-Elvhjem Homogenizer Fisher Scientific 08-414-14A Choose appropriate volume option
Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns Analytics-Shop AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column Analytics-Shop custom packed other sizes available
Resorcinol Sigma-Aldrich 30752-1
Rotary evaporator Buchi R-300
Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) Sigma-Aldrich 57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) Waters WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg Waters WAT036810
Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl Hamilton 80300
Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-933A
Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps Fisher Scientific 14-955-323 For ganglioside storage
TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat Fisher Scientific M1056350001 Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface
TLC reagent sprayer Fisher Scientific 05-723-26A
TLC running chamber for 10 x 10 cm plates Camag 22.5155
Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender Waring E8520

Referencias

  1. Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
  2. DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
  3. Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
  4. Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
  5. Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
  6. Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
  7. Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
  8. Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
  9. Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
  10. Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
  11. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  12. Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
  13. Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
  14. Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
  15. Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
  16. Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
  17. Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
  18. Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).

Play Video

Citar este artículo
Porter, M. J., Zhang, G., Schnaar, R. L. Ganglioside Extraction, Purification and Profiling. J. Vis. Exp. (169), e62385, doi:10.3791/62385 (2021).

View Video