Denne protokollen bruker fluorescerende reportere og cellesortering for å forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T-cellelinjer. To plasmider brukes til disse forenklede knock-in-eksperimentene, nemlig en CRISPR /Cas9- og DsRed2-uttrykkende plasmid og en homolog rekombinasjonsdonor plasmid som uttrykker EBFP2, som er permanent integrert ved Rosa26-locus i immunceller.
Funksjonelle genomikkstudier av immunsystemet krever genetiske manipulasjoner som innebærer både sletting av målgener og tilsetning av elementer til proteiner av interesse. Identifisering av genfunksjoner i cellelinjemodeller er viktig for genoppdagelse og utforskning av celleintrinsiske mekanismer. Imidlertid er genetiske manipulasjoner av immunceller som T-celler og makrofagcellelinjer ved hjelp av CRISPR / Cas9-mediert knock-in vanskelig på grunn av den lave transfeksjonseffektiviteten til disse cellene, spesielt i en passiv tilstand. For å modifisere gener i immunceller, brukes valg av legemiddelresistens og virale vektorer vanligvis til å berike celler som uttrykker CRIPSR / Cas9-systemet, noe som uunngåelig resulterer i uønsket inngrep av cellene. I en tidligere studie designet vi to fluorescerende reportere koblet til CRISPR/Cas9 som ble midlertidig uttrykt etter elektroporasjon. Denne tekniske løsningen fører til rask gensletting i immunceller; Imidlertid er gen-knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uten bruk av valg av legemiddelresistens eller virale vektorer enda mer utfordrende. I denne artikkelen viser vi at ved å bruke cellesortering for å hjelpe til med å velge celler som transient uttrykker CRISPR/Cas9-konstruksjoner rettet mot Rosa26-gresset i kombinasjon med en donorplasmid, kan gen-knock-in oppnås i både T-celler og makrofager uten berikelse av legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi hvordan man uttrykker menneskelig ACE2, en reseptor av SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nåværende Covid-19-pandemien, i RAW264.7 makrofager ved å utføre knock-in-eksperimenter. Slike gen knock-in celler kan brukes mye til mekanistiske studier.
Immunceller er kritiske for forsvar mot patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance av smittestoffer og vedlikehold av vev homeostase1,2. Cellelinjemodeller er viktige verktøy for å forstå det molekylære grunnleggende i pattedyrets immunsystem; de brukes i in vitro funksjonelle analyser, for eksempel de som modellerer menneskelig T-celleaktivering, og for å bestemme funksjonen til genetiske faktorer i å aktivere eller dempe immunresponser3,4. Det er viktig å merke seg at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent og like viktig, et stort antall molekyler kontrollerer differensiering, migrasjon og funksjon av en gitt celletype5,6.
Clustered Regelmessig Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktøy gir mulighet for genetisk manipulering av bestemte celletyper, noe som letter funksjonell merknad av gener på en presis måte7,8. Flere publiserte protokoller har beskrevet levering av CRISPR/Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplekser kjent som ribonukleoproteiner (RNPer) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokollene oppnås genmerking vanligvis ved å fusjonere en fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Det er imidlertid gjort få forsøk på å bruke to fluorescerende reportere, som er kompatible med enkeltcellesortering, for å lette knock-in-eksperimenter19,20, spesielt i immunceller.
Dyptgående mekanistiske analyser som tar sikte på å forstå funksjonene til en ny genetisk faktor i immunceller, krever generelt cellespesifikk sletting av et gen, genetiske redningseksperimenter og ideelt identifisering av interaktivitetene. Selv om metoder for optimalisering av genetisk sletting av gener i immunceller har blitt publisert9,15,21, er det rapportert langt færre metoder for å introdusere knock-in alleler med allsidige funksjoner for å forstå immunresponsen. Derfor, i denne protokollen tar vi sikte på å beskrive i detalj en effektiv og svært reproduserbar protokoll for å uttrykke et protein av interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murine immuncellelinjer. Vi designet et tofarget reportersystem for å berike for celler transfektert med plasmider som uttrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-mal (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Etter denne protokollen fikk vi flere knock-in linjer av den menneskelige T-cellelinjen Jurkat og murine makrofag RAW264.7 for funksjonelle analyser av dårlig studerte proteiner.
Som et eksempel viser vi i denne protokollen hvordan du får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrykker menneskelig ACE2 (en reseptor av SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involvert i patogenesen av Covid-1923,24 og menneskelig ACE2 anses som en stor reseptor som kreves for viral oppføring i celler før replikering, kan makrofager med knock-in av menneskelig ACE2 tjene som et nyttig verktøy for mekanistiske studier av viral multiplikasjon inne i makrofager. Parallelt presenterer vi også et eksempel på knock-in av et gen ved det menneskelige ROSA26-locus for å uttrykke RASGRP1-proteinet, som ble smeltet sammen ved sin amino terminus med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er viktige målceller i immunterapi, og et økende antall studier har fokusert på manipulering av deres respons på kreft25,26. Siden Rasgrp1 er kjent for å være et viktig signalmolekyl nedstrøms for T-cellereseptoren og dens interagere ikke er godt belyst27, gir OST-RASGRP1 knock-in-modellen grunnlaget for å identifisere interagere som regulerer T-cellenes respons på svulster og infeksjon. Samlet sett kan disse verktøyene brukes til Covid-19-studier og oppdagelsen av nye molekyler som samhandler med Rasgrp1.
I våre eksperimenter demonstrerte vi hvordan man utfører knock-in redigering i immunceller fra konstruksjonsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjelp av menneskelige Jurkat T-celler og murine RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-cellen og makrofagcellelinjene er motstandsdyktige mot transfeksjon36,37; Imidlertid kan problemet med lav effektivitet av CRISPR / Cas9-levering overvinnes ved hjelp av fluorescerende reportere kombinert med cell…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker strømningscytometrikjerneanlegget til Xinxiang Medical University. Utviklingen av slik teknologi har blitt støttet av NSFC-tilskudd 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbeidet støttes også av Stiftelsen Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.
Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |