Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostase^{tecidual 1,2}. Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes^3,4. É importante notar que o sistema imunológico dos mamíferos é extremamente heterogêneo e, igualmente importante, um enorme número de moléculas controla a diferenciação, migração e função de uma determinada célula tipo^5,6.

As ferramentas de edição de genomas curtas econsetos interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9 permitem a manipulação genética de tipos de células específicas, o que facilita a anotação funcional de genes de forma precisa^7,8. Vários protocolos publicados descreveram a entrega de CRISPR/Cas9 na forma de complexos de RNA de guia Cas9 conhecidos como ribonucleoproteínas (RNPs) em células HEK293, linhas celulares Jurkat, células T primárias^9,10,macrófagos^11,12,13, células-tronco¹⁴, e outras^15,16. Nesses protocolos, a marcação genética geralmente é alcançada fundindo uma tag fluorescente às proteínas endógenas^17,18. No entanto, poucas tentativas foram feitas para usar repórteres fluorescentes duplos, que são compatíveis com a classificação de células únicas, para facilitar experimentos de knock-in^19,20, particularmente em células imunes.

Análises mecanicistas aprofundadas destinadas a entender as funções de um novo fator genético em células imunes geralmente requerem a exclusão específica do tipo celular de um gene, experimentos de resgate genético e ideal identificação de seus interagirores. Embora métodos de otimização da exclusão genética de genes em células imunes tenham sido publicados^9,15,21, muito menos métodos foram relatados para introduzir alelos knock-in com funções versáteis para entender a resposta imune. Portanto, neste protocolo pretendemos descrever em detalhes um protocolo eficiente e altamente reprodutível para expressar uma proteína de interesse (POI) no lócus do porto seguro Rosa26 em linhas de células imunes humanas e murinas. Projetamos um sistema de repórter de duas cores para enriquecer para células transfeinadas com plasmídeos expressando CRISPR/Cas9 (DsRed2) e um modelo de DNA recombinante (EBFP2), que pode ser isolado por classificação celular. Seguindo este protocolo, obtivemos múltiplas linhas de knock-in da linha celular T humana Jurkat e macrófago murina RAW264.7 para análises funcionais de proteínas mal estudadas.

Como exemplo, mostramos neste protocolo como obter macrófagos RAW264.7 expressando compunção ace2 humano (receptor de SARS-Cov-2)²². Como as células imunes inatas estão envolvidas na patogênese do Covid-19^23,24 e o ACE2 humano é considerado um receptor importante necessário para a entrada viral nas células antes da replicação, macrófagos com knock-in do ACE2 humano podem servir como uma ferramenta útil para estudos mecanicistas de multiplicação viral dentro de macrófagos. Em paralelo, também apresentamos um exemplo de knock-in de um gene no lócus ROSA26 humano para expressar a proteína RASGRP1, que foi fundida em seu amino terminus com uma afinidade Twin-Strep-tag (OST). As células T são células-alvo-chave em terapias imunológicas, e um número crescente de estudos tem se concentrado na manipulação de sua capacidade de resposta ao câncer^25,26. Como rasgrp1 é conhecido por ser uma molécula-chave de sinalização a jusante do receptor de células T e seus interagirres não são bem elucidados²⁷, o modelo de knock-in OST-RASGRP1 fornece a base para identificar interactores que regulam a resposta das células T a tumores e infecções. Juntas, essas ferramentas podem ser usadas para estudos covid-19 e a descoberta de novas moléculas interagindo com Rasgrp1.