Summary

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Published: January 30, 2021
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Abstract

Epitheliale Dysregulation ist ein Knoten für eine Vielzahl von menschlichen Zuständen und Beschwerden, einschließlich chronischer Wunden, Entzündungen und über 80% aller menschlichen Krebsarten. Als Auskleidungsgewebe ist das Hautepithel oft Verletzungen ausgesetzt und hat sich evolutionär angepasst, indem es die zelluläre Plastizität erworben hat, die zur Reparatur von geschädigtem Gewebe erforderlich ist. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um die epitheliale Plastizität mit in vitro und ex vivo zellbasierten Modellen zu untersuchen. Diese Bemühungen waren jedoch in ihrer Fähigkeit, die verschiedenen Phasen der Plastizität von Epithelzellen zu rekapitulieren, begrenzt. Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von 3D-epidermalen Sphäroiden und epidermalen Sphäroidzellen aus primären neonatalen menschlichen Keratinozyten. Dieses Protokoll beschreibt die Fähigkeit epidermaler Sphäroidkulturen, verschiedene Stadien der generativen Plastizität von Keratinozytenfunktionalität funktionell zu modellieren, und zeigt, dass die epidermale Sphäroid-Neubeschichtung heterogene normale menschliche Keratinozytenkulturen (NHKc) für integrinα6hi/EGFRlo Keratinozyten-Subpopulationen mit verbesserten stammähnlichen Eigenschaften anreichern kann. Unser Bericht beschreibt die Entwicklung und Aufrechterhaltung eines Hochdurchsatzsystems zur Untersuchung der Plastizität der Hautkeratinozyten und der epidermalen Regeneration.

Introduction

Das geschichtete Epithel von Säugetieren ist die komplexeste Epithelarchitektur in allen lebenden Systemen und ist am häufigsten Schäden und Verletzungen ausgesetzt. Als Schutzgewebe hat sich das geschichtete Epithel entwickelt, um eine komplexe und effektive Gewebeschadensreaktion zu erzeugen. Bei Verletzungen müssen diese Zellen Linienplastizitätsprogramme aktivieren, die es ihnen ermöglichen, an die verletzte Stelle zu wandern und die Reparatur1,2,3durchzuführen . Diese facettenreiche Reaktion erfolgt in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die noch wenig verstanden werden.

Ein großes Hindernis bei der Untersuchung des komplizierten Prozesses der epithelialen Regeneration liegt im Mangel an Hochdurchsatzmodellsystemen, die dynamische zelluläre Aktivitäten in definierten Stadien der Zellregeneration erfassen können. Während In-vivo-Mausmodelle relevante Einblicke in die Wundheilung bieten und den menschlichen Regenerationsprozess am ehesten rekapitulieren, erfordert ihre Entwicklung mühsame Anstrengungen und erhebliche Kosten, was ihre Durchsatzkapazität einschränkt. Es besteht daher ein kritischer Bedarf an der Etablierung von Systemen, die eine funktionelle Untersuchung der Regeneration von menschlichem Epithelgewebe im Hochdurchsatzbereich ermöglichen.

In den letzten Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, die Herausforderung der Skalierbarkeit zu meistern. Dies zeigt sich in der großen Ausweitung innovativer zellbasierter In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, die den regenerativen In-vivo-Kontext genau nachahmen. Dazu gehören Fortschritte bei Organ-on-Chip4, Sphäroid5, Organoid6und organotypischen Kulturen7. Diese zellbasierten 3D-Systeme bieten jeweils einzigartige Vorteile und stellen unterschiedliche experimentelle Einschränkungen dar. Bis heute ist die Sphäroidkultur das kostengünstigste und am weitesten verbreitete 3D-Zellkulturmodell. Und während mehrere Berichte darauf hingewiesen haben, dass Sphäroidkulturen verwendet werden können, um Hautstammzelleigenschaften zu untersuchen, wurden diese Studien größtenteils mit tierischem Gewebe8,9oder mit dermalen Fibroblasten10durchgeführt, wobei praktisch keine Berichte die regenerativen Eigenschaften menschlicher epidermaler Sphäroidkulturen gründlich charakterisieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die funktionelle Entwicklung, Kultur und Aufrechterhaltung epidermaler Sphäroidkulturen aus normalen menschlichen Keratinozyten (NHKc). Wir beschreiben auch den Nutzen dieses Systems, um die sequentiellen Phasen der epidermalen Regeneration und der Plastizität von Keratinozytenstammzellen in vitro zu modellieren.

Protocol

Das Protokoll für die Sammlung und Handhabung von Hautproben und die Isolierung menschlicher Keratinozyten wurde von der University of South Carolina (UofSC) IRB überprüft und als “Forschung ohne menschliche Probanden” eingestuft, da die Vorhautproben chirurgische Rückwürfe waren, die bei routinemäßigen chirurgischen Eingriffen (Beschneidung von Neugeborenen) produziert wurden und völlig frei von identifizierenden Informationen waren. Das Protokoll wurde auch regelmäßig vom UofSC-Ausschuss für biologische Sich…

Representative Results

Während des Hautepidermosphärentests werden NHKc-Kulturen in Agarose-beschichteten Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgesät (Abbildung 1A). Sphäroidbildende Zellen sollten sich innerhalb von 48 Stunden selbst aggregieren. Die autonome Sphäroidbildung kann bereits nach 24 Stunden mit einem Standard-Invertierten Phasenkontrastmikroskop beurteilt werden. Hautepidermosphärenbildung und Re-Plating-Assay modellieren verschiedene Phasen der epidermalen Geweberegeneration (<strong class="xfi…

Discussion

Die Verwendung von 3D-Sphäroidkultursystemen hat einen breiten Nutzen bei der Beurteilung der Zellstammhaftigkeit. Es wurde gezeigt, dass diese Systeme die Anreicherung von Gewebestammzellenverbessern 13, aber ihr Nutzen für die Untersuchung menschlicher epidermaler Stammzellen wurde nur begrenzt untersucht. Hier beschreiben wir eine Strategie zur Anreicherung menschlicher Keratinozyten-Stammzellen mittels 3D-Kulturtechniken. In diesem System werden NHKc als selbstorganisierende mehrzellige Sph?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bot Zugang zu Bildgebungs- und Zellsortiergeräten sowie technischer Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Förderung 1R21CA201853 unterstützt. Das MCF und das IRF erhalten teilweise Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM103499, SC INBRE. Das MCF erhält auch Unterstützung durch den NIH-Zuschuss P20GM109091. Yvon Woappi wurde teilweise durch NIH-Stipendien 2R25GM066526-06A1 (PREP) und R25GM076277 (IMSD) sowie durch ein Stipendium des Grace Jordan McFadden Professors Program an der UofSC unterstützt. Geraldine Ezeka und Justin Vercellino wurden durch NIH-Zuschüsse 2R25GM066526-10A1 (PREP) an der UofSC unterstützt. Sean M. Bloos wurde mit dem Magellan Scholar Award 2016 an der UofSC unterstützt.

Materials

Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

Referencias

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

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Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

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