Summary

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Published: August 11, 2021
doi:

Summary

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Abstract

Monoamin-Neurotransmitter sind mit zahlreichen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen verbunden. Tiermodelle solcher Zustände haben Veränderungen in der Freisetzungs- und Aufnahmedynamik von Monoamin-Neurotransmittern gezeigt. Technisch komplexe Methoden wie Elektrophysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), Bildgebung, In-vivo-Mikrodialyse, Optogenetik oder die Verwendung von Radioaktivität sind erforderlich, um die Monoaminfunktion zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ist ein optimierter zweistufiger Ansatz zum Nachweis der Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten unter Verwendung einer 48-Well-Platte mit Gewebehaltern zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD) zur Messung der Monoaminfreisetzung. Kurz gesagt, Rattenhirnschnitte, die Regionen von Interesse enthielten, einschließlich präfrontaler Kortex, Hippocampus und dorsales Striatum, wurden mit einem Gewebeschneider oder Vibratom erhalten. Diese interessanten Regionen wurden aus dem gesamten Gehirn seziert und in einem mit Sauerstoff angereicherten physiologischen Puffer inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde während des gesamten Versuchszeitraums durch 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay untersucht. Die akut sezierten Hirnregionen wurden unter verschiedenen Medikamentenbedingungen inkubiert, von denen bekannt ist, dass sie die Monoaminfreisetzung durch den Transporter (Amphetamin) oder durch die Aktivierung der exozytotischen vesikulären Freisetzung (KCl) induzieren. Nach der Inkubation wurden die freigesetzten Produkte im Überstand gesammelt und durch ein HPLC-ECD-System analysiert. Hier wird die basale Monoaminfreisetzung mittels HPLC aus akuten Hirnschnitten nachgewiesen. Diese Daten unterstützen frühere In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse, die zeigen, dass AMPH und KCl die Monoaminfreisetzung induzieren. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die mit einer von Monoamintransportern abhängigen Freisetzung verbunden sind, und bietet die Möglichkeit, Verbindungen, die die Monoaminfreisetzung beeinflussen, schnell und kostengünstig zu screenen.

Introduction

Eine Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen ist mit einer Dysregulation oder unzureichenden Aufrechterhaltung des Monoamin-Neurotransmitters (Dopamin [DA], Serotonin [5-HT], Noradrenalin [NE]) der Homöostase verbunden1,2,3. Zu diesen Erkrankungen gehören unter anderem Depressionen1,2, Schizophrenie2, Angstzustände2, Sucht4, Menopause5,6,7, Schmerzen8 und Parkinson3. Zum Beispiel haben mehrere Rattenmodelle der Menopause gezeigt, dass die Dysregulation oder Reduktion von Monoaminen im Hippocampus, im präfrontalen Kortex und im Striatum sowohl mit Depressionen als auch mit kognitivem Verfall verbunden sein kann, was bei Frauen in den Wechseljahren beobachtet wird. Die Dysregulation von Monoaminen in diesen Modellen wurde ausführlich mit HPLC-ECD untersucht, obwohl die Studien nicht zwischen dem gemessenen Neurotransmittergehalt und der Freisetzung von Neurotransmittern unterschieden5,6,7. Monoamine werden klassischerweise durch Ca2+-abhängige vesikuläre Freisetzung9 in den extrazellulären Raum freigesetzt und durch ihr jeweiliges Plasmamembran-Wiederaufnahmesystem (Dopamintransporter, DAT; Serotonintransporter, SERT; Noradrenalintransporter, NET) wieder recycelt 10,11. Umgekehrt deuten die Daten darauf hin, dass diese Transporter in der Lage sind, Monoamine freizusetzen oder auszuströmen, da für Missbrauchsdrogen wie Amphetamin (AMPH) und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) bekannt ist, dass sie DA bzw. 5-HT über ihre Transportersysteme freisetzen12,13,14,15,16,17 . Daher ist ein richtiges mechanistisches Verständnis der Monoaminfreisetzungsdynamik entscheidend für die Entwicklung spezifischer und zielgerichteter Pharmakotherapien.

Zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung wurde eine breite Palette von Techniken eingesetzt, wie z. B. Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, In-vivo-Mikrodialyse13, Bildgebung19, Präinkubation mit radioaktiv markierten Monoaminen20, Optogenetik und in jüngerer Zeit genetisch kodierte Fluoreszenzsensoren und Photometrie21,22 . FSCV und In-vivo-Mikrodialyse sind die primären Techniken zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung. FSCV wird verwendet, um die stimulierte exozytotische Freisetzung von hauptsächlich DA in akuten Hirnschnitten und in vivo23 zu untersuchen. Da FSCV Elektroden verwendet, um die Freisetzung zu stimulieren oder hervorzurufen, ist die primäre Quelle der Freisetzung von Neurotransmittern die Ca2 +-abhängige vesikuläre Freisetzung18,24,25,26,27,28,29,30,31 . Die In-vivo-Mikrodialyse in Verbindung mit HPLC misst Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitterspiegel mit einer Sonde, die in einem Hirnareal von Interesse platziert wird13,32. Ähnlich wie bei FSCV ist eine wesentliche Einschränkung der In-vivo-Mikrodialyse die Schwierigkeit, die Quelle der Neurotransmitterfreisetzung zu bestimmen: Ca2+-abhängige vesikuläre Freisetzung oder Transporterabhängigkeit. Bemerkenswert ist, dass beide Methoden die direkte Messung der Monoaminfreisetzung ermöglichen. Durch die jüngste Weiterentwicklung der Optogenetik zeigt die Forschung den Nachweis einer 5-HT- und DA-Freisetzung in kurzer Zeit mit exquisiter Zelltypspezifität21,22. Diese Strategien erfordern jedoch komplexe und kostspielige Techniken und Geräte und messen indirekt die Monoaminfreisetzung, insbesondere durch Monoaminbindung an Rezeptoren. Darüber hinaus werden radioaktiv markierte Monoamine auch zur Untersuchung der Monoamindynamik verwendet. Radioaktiv markierte Monoamine können in verschiedene Modellsysteme vorgeladen werden, wie z.B. heterologe Zellen, die jeden Monoamintransporter überexprimieren20,33,34,35,36,37,38,39,40, primäre Neuronen20, Synaptosomen33,39,41, 42 und akute Hirnschnitte43,44. Radioaktivität stellt jedoch einen potenziellen Schaden für den Experimentator dar, und die tritiummarkierten Analyten rekapitulieren möglicherweise nicht getreu die endogene Monoamindynamik45,46. Superfusionssysteme in Kombination mit Offline-Nachweismethoden wie HPLC-ECD haben den Nachweis von Monoaminen aus mehreren Gewebequellen ermöglicht. Hier bietet dieses Protokoll als optimierte und kostengünstige, einfache und präzise Methode unter Verwendung akuter Hirnschnitte, um die endogene basale und stimulierte Monoaminfreisetzung direkt zu messen.

Akute Hirnschnitte ermöglichen das Testen mechanistischer Hypothesen, vor allem, da sie die anatomische In-vivo-Mikroumgebung erhalten und intakte Synapsen beibehalten47,48,49,50,51,52. In einigen Studien wurden akute Hirnschnitte oder gehacktes Hirngewebe in Verbindung mit einer Superfusionstechnik verwendet, bei der KCl zur Stimulierung der Ca2+-vermittelten Freisetzung verwendet wurde53,54,55,56. Superfusionssysteme waren entscheidend, um das Verständnis der Freisetzungsmechanismen von Neurotransmittern, einschließlich Monoaminen, voranzutreiben. Diese Systeme sind jedoch relativ teuer, und die Anzahl der für die Gewebeanalyse verfügbaren Kammern reicht von 4 bis 12. Im Vergleich dazu ist die hier vorgestellte Methode kostengünstig, ermöglicht die Messung von 48 Gewebeproben und kann auf bis zu 96 Gewebeproben verfeinert werden. Jede Vertiefung innerhalb der 48-Well-Platte enthält Gewebehalter, die Filter verwenden, um das freigesetzte Produkt vom Gewebe zu trennen, und freigesetzte Monoamine werden dann gesammelt und durch HPLC-ECD analysiert. Wichtig ist, dass diese Methode die gleichzeitige Messung der 5-HT-, DA- und NE-Freisetzung aus verschiedenen Gehirnbereichen wie dem präfrontalen Kortex, dem Hippocampus und dem dorsalen Striatum nach behandlung mit pharmakologischen Wirkstoffen ermöglicht, die die Monoaminfreisetzung modulieren. So kann der Experimentator mehrere Fragen mit einem kostengünstigen Multi-Well-System beantworten, das die Anzahl der getesteten Proben erhöht und dadurch die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert.

Protocol

Alle Experimente, einschließlich tierexperimenteller Handhabung und Gewebeentnahme, wurden in Übereinstimmung mit der University of Florida und dem City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) nach den genehmigten Protokollen 201508873 (UF) und 1071 (CCNY) durchgeführt. Reagenzien und Puffer entnehmen Sie bitte der Ergänzungsdatei. 1. Bereiten Sie akute Rattenhirnschnitte vor ANMERKUNG: In diesem Versuch wurden erwa…

Representative Results

Diese Technik beschreibt die Verwendung von Hirnschnitten zur Messung der Freisetzung von endogenen Monoaminen mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion basierend auf einer 48-Well-Platte mit einem internen Gewebehalter. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes bis zum Ende der Experimente sicherzustellen, wurde zunächst ein MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-…

Discussion

Monoaminfreisetzungsmessungen werden seit Jahren in einer Reihe von Systemen wie heterologen Zellen, neuronalen Kulturen, Gehirnsynaposomen, ex vivo akuten Hirnschnitten und ganzen Tieren durchgeführt13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup class="xref…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse Fondecyt Initiation Fund N 11191049 an J.A.P. und den NIH-Zuschuss DA038598 an G.E.T. unterstützt.

Materials

48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

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