Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

على الرغم من حقيقة أن حزم المجسمة في خلايا الشعر السمعية كبيرة بما يكفي لتصورها عن طريق المجهر البصري وانحرافها في الخلايا الحية في تجربة المشبك التصحيح ، يمكن تصوير المكونات الهيكلية الأساسية لآلات النقل مثل روابط البقشيش فقط مع المجهر الإلكتروني في الخلايا الميتة. في خلايا الشعر السمعي الثديي ، تقع آلات النقل في الطرف السفلي من روابط الطرف ، أي على أطراف الصف الأقصر stereocilia¹ وتنظم محليا من خلال الإشارات على نصائح من stereocilia^2،3. ومع ذلك ، فإن التصوير الخالي من التسمية للهياكل السطحية في هذا الموقع في خلايا الشعر الحية غير ممكن بسبب الأحجام الصغيرة من الاستريوسيليا.

القوقعة الثديية لديها نوعين من الخلايا الحسية السمعية: خلايا الشعر الداخلية والخارجية. في خلايا الشعر الداخلية، ستيريوسيليا أطول وأكثر سمكا بالمقارنة مع تلك الموجودة في خلايا الشعر الخارجي⁴. الصف الأول والثاني من ستيريوسيليا يبلغ قطرها 300-500 نانومتر في الماوس أو الفئران خلايا الشعر الداخلية. نظرا لحيود الضوء ، فإن الحد الأقصى للدقة القابلة للتحقيق باستخدام مجهر بصري خال من التسمية هو حوالي 200 نانومتر. وبالتالي ، فإن تصور المجسمة الفردية داخل الصفين الأول والثاني من حزمة خلايا الشعر الداخلية أمر سهل نسبيا مع المجهر البصري. في المقابل، أقصر صف مجسمة في خلايا الشعر الداخلية وجميع مجسمة من خلايا الشعر الخارجي لها أقطار حول 100-200 نانومتر ولا يمكن تصور مع المجهر البصري⁵. على الرغم من التقدم الأخير في التصوير فائق الدقة ، إلا أن هذا القيد الأساسي لا يزال قائما في أي تصوير بصري خال من التسمية. جميع التقنيات المتاحة تجاريا الحالية فائقة الدقة لا تتطلب نوعا من جزيئات الفلورسنت⁶، مما يحد من تطبيقاتها. بالإضافة إلى القيود بسبب الحاجة إلى جزيئات محددة الموسومة الفلورسنت، وقد ثبت التعرض للإشعاع الضوء المكثف للحث على الضرر الخلوي، ويمكن أن تؤثر على العمليات الخلوية، وهو عيب كبير عند دراسة الخلايا الحية⁷.

وقد تم الحصول على معرفتنا الحالية من التفاصيل ultrastructural من حزم مجسمة خلايا الشعر في الغالب مع مختلف تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) ، مثل المسح المجهري الإلكتروني (SEM)، المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، تجميد كسر EM، ومؤخرا مع تقنيات 3D مثل تقسيم المسلسل مع شعاع أيون مركزة أو التصوير المقطعي cryo-EM^{8،9،10،11،12،13، 14،15،16}. لسوء الحظ، تتطلب جميع تقنيات EM هذه إزالة كيميائية أو التبريد للعينة. اعتمادا على النطاق الزمني للظواهر ، وهذا الشرط يجعل دراسة العمليات الديناميكية في نصائح من stereocilia إما مستحيلة أو كثيفة العمالة جدا.

بذلت جهود محدودة لتصوير حزم الشعر من خلايا الشعر الحية مع المجهر القوة الذرية (AFM)^17،18. منذ AFM يعمل في الحلول الفسيولوجية، فإنه يمكن، من الناحية النظرية، تصور التغيرات الديناميكية في حزم ستيريوسيليا من خلايا الشعر الحية مع مرور الوقت. تكمن المشكلة في مبادئ AFM عالية الدقة ، والتي تنطوي على اتصال جسدي معين بين مسبار AFM والعينة ، حتى في وضع “التنصت” الأقل ضررا¹⁹. عندما يواجه مسبار AFM مجسما ، فإنه عادة ما يصطدم به ، مما يضر ببنية حزمة الشعر. ونتيجة لذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لتصور العيش، أو حتى ثابتة، حزم خلايا الشعر^17،18. قد يتم تخفيف المشكلة جزئيا باستخدام مسبار AFM كبير على شكل كرة يفرض فقط القوى الهيدروديناميكية على سطح العينة^20. ومع ذلك ، على الرغم من أن مثل هذا المسبار مناسب بشكل مثالي لاختبار الخصائص الميكانيكية للعينة²¹، فإنه يوفر فقط دقة دون ميكرومتر عند تصوير جهاز Corti²² ولا يزال ينطبق على العينة قوة قد تكون كبيرة لحزم الاستريوميليا الحساسة للغاية.

المسح المجهري توصيل أيون (SICM) هو نسخة من المسح المجهري التحقيق الذي يستخدم مسبار ماصة زجاجية مليئة محلول موصل²³. يكتشف SICM السطح عندما تقترب المصصة من الخلية وينخفض التيار الكهربائي من خلال المصصة. وبما أن هذا يحدث قبل لمس الخلية ، فإن SICM مناسب بشكل مثالي للتصوير غير الاتصالي للخلايا الحية في الحل الفسيولوجي²⁴. أفضل قرار من SICM هو على ترتيب نانومتر واحد، والذي يسمح حل مجمعات البروتين الفردية في غشاء البلازما من خلية حية²⁵. ومع ذلك ، على غرار تقنيات مسبار المسح الأخرى ، فإن SICM قادر على تصوير الأسطح المسطحة نسبيا فقط. تغلبنا على هذا القيد عن طريق اختراع القفز مسبار أيون المجهر التوصيل (HPICM)²⁶، الذي يقترب nanopipette العينة في كل نقطة التصوير(الشكل 1A). باستخدام HPICM، كنا قادرين على صورة حزم stereocilia في خلايا الشعر السمعية الحية مع دقة نانوية²⁷.

ميزة أساسية أخرى لهذه التقنية هي أن HPICM ليست فقط أداة تصوير. على النقيض من تقنيات مسبار المسح الضوئي الأخرى ، فإن مسبار HPICM / SICM هو قطب كهربائي يستخدم على نطاق واسع في فسيولوجيا الخلايا للتسجيلات الكهربائية والتسليم المحلي لمختلف المحفزات. نشاط قناة أيون لا تتداخل عادة مع التصوير HPICM، لأن التيار الكلي من خلال التحقيق HPICM هو عدة أوامر من حجم أكبر من التيار خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة أكبر القنوات الأيونية²⁵. ومع ذلك، HPICM يسمح تحديد المواقع الدقيقة للnanopipette على هيكل من الاهتمام وتسجيل التصحيح المشبك قناة واحدة لاحقة من هذا الهيكل²⁸. هذه هي الطريقة التي حصلنا على التسجيلات الأولية الأولى من نشاط قناة واحدة في نصائح من خلية الشعر الخارجي stereocilia²⁹. ومن الجدير بالذكر أنه حتى تيار كبير من خلال nanopipette لا يمكن أن تنتج تغييرات كبيرة في الإمكانات عبر غشاء البلازما بسبب تحويلة كهربائية هائلة من المتوسط خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تنشيط القنوات الأيونية الفردية ميكانيكيا عن طريق تدفق السائل من خلال nanopipette³⁰ أو كيميائيا عن طريق التطبيق المحلي لناهض³¹.

في HPICM، يتم إنشاء الصورة عندما تقترب nanopipette من العينة بشكل تسلسلي عند نقطة واحدة، وتتراجع، ثم تتحرك في اتجاه الجانبي لتكرار النهج (الشكل 1A). مكبر للصوت المشبك التصحيح ينطبق باستمرار الجهد إلى سلك AgCl في ماصة (الشكل 1B) لتوليد تيار من ~ 1 ن أ في حل الحمام. يتم تحديد قيمة هذا التيار عندما يتم تحديد ماصة بعيدا عن سطح الخلية كتيار مرجعي (أنا_المرجع، الشكل 1C). ثم ينتقل المواسير في المحور Z للاقتراب من العينة حتى يتم تقليل التيار بمقدار معرف مسبقا من قبل المستخدم (نقطة تعيين)، وعادة 0.2٪-1٪ من _المرجع الأول (الشكل 1C، تتبع أعلى). ثم يحفظ النظام قيمة Z في هذه اللحظة كطول العينة، جنبا إلى جنب مع إحداثيات X و Y لنقطة التصوير هذه. ثم يتم سحب ماصة بعيدا عن السطح(الشكل 1C،تتبع أسفل) بسرعة يحددها المستخدم، وعادة 700-900 نانومتر / مللي ثانية. بعد التراجع ، يتم نقل ماصة (أو ، في حالتنا ، العينة – انظر الشكل 1B)أفقيا إلى نقطة التصوير التالية ، ويتم الحصول على قيمة مرجعية جديدة الحالية ، ويقترب المصصة مرة أخرى من العينة ، وتكرار العملية. ويفضل حركة X-Y من ماصة في إعداد المجهر تستقيم التي تستخدم عادة لتسجيلات تيارات خلية الشعر mechanotransduction. في هذا الإعداد، يقترب مسبار HPICM من حزم خلايا الشعر ليس من الأعلى ولكن بزاوية³². ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل دقة للتصوير HPICM في إعداد المجهر المقلوب(الشكل 1A، B) ، حيث يتم إزالة حركة العينة في اتجاهات X-Y من حركة Z من nanopipette ، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية الميكانيكية المحتملة.

باستخدام HPICM، حصلنا على الصور الطبوغرافية من الماوس والفأر الداخلية والخارجية حزم ستيريوسيليا خلية الشعر، وحتى تصور الروابط بين ستيريوسيليا التي هي حوالي 5 نانومتر في القطر^26،27. نجاح التصوير حزمة خلايا الشعر مع هذه التقنية يعتمد على عدة عوامل. أولا، يجب أن يكون الضجيج (التباين) لتيار nanopipette صغيرا قدر الإمكان للسماح بأقل نقطة تعيين ممكنة للتصوير HPICM. تسمح نقطة تعيين منخفضة للتحقيق HPICM ب “استشعار” سطح ستيريوسيليا على مسافة أكبر وفي أي زاوية لنهج المسبار ، ومن المدهش أنه يحسن دقة X-Y للتصوير HPICM (انظر المناقشة). ثانيا، ينبغي تخفيض الاهتزازات والانجرافات في النظام إلى أقل من 10 نانومتر، لأنها تسهم مباشرة في القطع الأثرية التصوير. وأخيرا، على الرغم من أن المسبار HPICM ومرحلة العينة يتم نقلها في محاور Z و X-Y بواسطة مشغلات بيزو التي يتم التحكم فيها من خلال التغذية المرتدة التي تحتوي على دقة نانومتر واحد أو أفضل، فإن قطر طرف nanopipette يحدد انتشار التيار (حجم الاستشعار) وبالتالي القرار (الشكل 1A). لذلك ، قبل تصوير خلايا الشعر الحية ، من الضروري سحب المصايب الكافية ، والوصول إلى الدقة المطلوبة مع عينات المعايرة ، وتحقيق ضوضاء منخفضة في نظام التسجيل.

على الأقل بضعة عقود، تقنية SICM لم تكن متاحة تجاريا، وأنها قد تم تطويرها من قبل عدد قليل فقط من المختبرات في العالم مع المختبر الرائدة من البروفيسور كورشيف في الكلية الإمبراطورية (المملكة المتحدة). في الآونة الأخيرة، أصبحت العديد من أنظمة SICM متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)،وكلها تستند إلى مبادئ HPICM الأصلية. ومع ذلك ، فإن حزم التصوير المجسمة في خلايا الشعر تتطلب العديد من التعديلات المخصصة التي تشكل تحديا تقنيا (أو حتى مستحيلا) في أنظمة “الجاهزة” المغلقة. لذلك، هناك حاجة إلى بعض التكامل بين المكونات. منذ إعداد HPICM يمثل تلاعب المشبك التصحيح مع الاهتزاز أكثر صرامة ومتطلبات الانجراف وحركة بيزو يحركها من المسبار HPICM والعينة (الشكل 1D)، وهذا التكامل من السهل نسبيا لأي باحث، الذي يتقن في لقط التصحيح. ومع ذلك ، فإن عالما من دون خلفية مناسبة تحتاج بالتأكيد بعض التدريب في علم الفيزيولوجيا الكهربائية أولا. على الرغم من التحديات المتبقية مثل زيادة سرعة التصوير (انظر المناقشة)، تمكنا من تصوير حزم stereocilia في خلايا الشعر الحية بدقة نانوية دون إتلافها.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير HPICM ناجح لحزم خلايا الشعر السمعية الحية في الفئران الصغيرة بعد الولادة أو النباتات الخارجية ل قوقعة الماوس باستخدام نظامنا المخصص. يتم سرد المكونات المتكاملة في جدول المواد. كما توضح الورقة المشاكل الشائعة التي يمكن مواجهتها وكيفية استكشافها وإصلاحها.