Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

Tarmslimhinden omfatter et enkelt lag af columnar tarmepitele celler (IECs), underliggende lamina propria immunceller og muscularis slimhinden. Udover sin rolle i absorptionen af næringsstoffer er tarmepitelet en fysisk barriere, der beskytter kroppens indre mod lysmæssige commensale bakterier, patogener og diætantigener. Derudover koordinerer IIC’er og lamina propria immunceller immunresponset, der fremkalder enten tolerance eller respons afhængigt af konteksten og stimuli. Det er blevet rapporteret, at forstyrrelsen af epitelbarrieren kan gå forud for starten af patologisk slimhindebetændelse og bidrage til inflammatorisk tarmsygdom (IBD), der omfatter både colitis ulcerosa og Crohns sygdom¹, 2^,3,4,5,6,7. Personer med colitis ulcerosa udgør overdreven transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), der danner krypt abscesser, et fund, der har været forbundet med sværhedsgraden af sygdom^8,9. Selv om kompromitteret epitel barriere funktion og overdreven immunrespons er kendetegnende for IBD, der er en mangel på eksperimentelle in vivo assays til at udføre kvantitative vurderinger af tarm permeabilitet og immuncelle rekruttering i tarmslimhinden.

De mest almindelige metoder til undersøgelse af tarmepitelet permeabilitet og PMN TEpM anvender ex vivo kammerbaserede metoder ved hjælp af IEC monolayers dyrket på semi-gennemtrængelige porøse membranindsatser^10,11,12. Epitelbarrierens integritet overvåges enten ved målinger af transepithelial elektrisk modstand (TEER) eller fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran fra apikale til basale rum^13,14,15. Tilsvarende er PMN TEpM typisk undersøgt som reaktion på en kemoattratant, der tilsættes i det nederste kammer¹⁶. PMN placeres i det øverste kammer, og efter en inkubationsperiode opsamles og kvantificeres PMN, der er migreret ind i det basale rum. Selv om disse metoder er nyttige, lette at udføre og meget reproducerbare, er de naturligvis reduktionistiske tilgange og repræsenterer ikke nødvendigvis en nøjagtig afspejling af in vivo-forholdene.

Hos mus er en almindelig analyse til undersøgelse af tarmparacellulær permeabilitet ved oral sonde af FITC-dextran og efterfølgende måling af FITC-dextran udseende i blodserummet^13,17. Ulempen ved denne analyse er, at den repræsenterer en vurdering af gastrointestinale tarmkanalens overordnede barriereintegritet snarere end af regionale tarmbidrag. Derudover er Evans blå almindeligt anvendt til at evaluere vaskulær lækage in vivo¹⁸ og har også været ansat til at evaluere tarmslimhindepermeabilitet hos mus og rotte^19,20,21. Kvantificeringen af Evans blå i tarmslimhinden kræver ekstraktion fra væv, der anvender inkubation i formamid natten over. Derfor kan det samme væv ikke bruges til at studere tarmepitelelengerbarhed og neutrofil infiltration.

Her fremhæver vi en simpel protokol, der reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for at indsamle reproducerbare data om colon slimhindegennemtrængelighed og leukocyttransepithelial migration in vivo. Vi anbefaler derfor brugen af FITC-dextrans, der let kan påvises i blodserum uden at gå på kompromis med integriteten af tarmsløjfer, som kan høstes til yderligere analyse. Det skal bemærkes, at tarmlakerede sløjfer er blevet anvendt i forskellige arter (herunder mus, rotter, kaniner, kalve) til undersøgelse af bakteriel infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)^22,23,24,25 samt tarmgennemtrængelighed²⁶; Men så vidt vi ved, er der ingen undersøgelser, der undersøger mekanismer af PMN TEpM i specifikke regioner i tarmen, såsom ileum eller tyktarm, der er almindeligt involveret i IBD.

Her beskriver vi musens tarmsløjfe (iLoop) model, der er en robust og pålidelig mikrokirurgisk in vivo-metode, der anvender et godt vaskulært og udvendigt tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og gør det muligt at vurdere tarmbarrierens integritet og PMN TEpM på levende mus under anæstesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantificering af serumniveauer på 4 kDa FITC-dextran efter intraluminale administration i iLoop 2) kvantificering af transmigreret PMN i iLoop lumen efter intraluminale injektion af potente chemottractant Leukotriene B₄ (LTB₄)²⁷. Desuden udnytter iLoop-modellen med Jam-a-nullmus eller mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) sammenlignet med kontrolmus er vi i stand til at bekræfte tidligere undersøgelser, der har rapporteret et stort bidrag til stramt krydsrelateret protein JAM-A til tarmgennemtrængelighed og neutrofil transmigration^{15,28,29,30,31}.

iLoop-modellen er en yderst funktionel og fysiologisk metode, der kan bruges til at bekræfte in vitro-assays. Desuden er dette en alsidig eksperimentel model, der gør det muligt at studere forskellige reagenser, der kan injiceres i løkken lumen, herunder kemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapi.