Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi
Summary
Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.
Abstract
Bağırsak mukozası, luminal bakterilerin ve eksojen maddelerin geçişini önlerken besinlerin ve suyun paraselüller taşınmasına izin veren dinamik bir bariyer oluşturan tek bir epitel hücre tabakası ile kaplıdır. Bu tabakanın ihlali, her ikisi de inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) da dahil olmak üzere bağırsaktaki patolojik durumların ayırt edici özellikleri olan ışık içeriğine geçirgenliğin artmasına ve bağışıklık hücrelerinin işe alınmasına neden olur.
Polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) epitel bariyer fonksiyonunu ve transepithelial göçlerini (TEpM) düzenleyen mekanizmalar, nicel analizlere izin eden deneysel in vivo yöntemlerin eksikliği nedeniyle eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam bir murine deneysel modelini tarif ediyoruz. Dışsallaştırılmış bağırsak döngüsü (iLoop) tamamen damarlıdır ve epitel hücre monolayerleri arasında geçirgenlik ve PMN göçünü incelemek için yaygın olarak kullanılan ex vivo oda bazlı yaklaşımlara göre fizyolojik avantajlar sunar.
Bu modelin iki uygulamasını ayrıntılı olarak gösteriyoruz: (1) intralüminal enjeksiyondan sonra serumda floresan etiketli dekstransın tespiti yoluyla bağırsak geçirgenliğinin nicel ölçümü, (2) böbrek içi kemoattratantların intralüminal girişinden sonra bağırsak lümenine göç eden PMN’nin nicel değerlendirmesi. Bu modelin fizibilitesini gösteriyoruz ve kontrollere kıyasla epitel sıkı kavşakla ilişkili protein JAM-A’dan yoksun farelerde iLoop’u kullanarak sonuçlar sağlıyoruz. JAM-A’nın enflamatuar yanıtlar sırasında PMN TEpM’nin yanı sıra epitel bariyer fonksiyonunu da düzenlediği gösterilmiştir. iLoop’u kullanan sonuçlarımız önceki çalışmaları doğrular ve homeostaz ve hastalık sırasında bağırsak geçirgenliğinin düzenlenmesinde JAM-A’nın ve in vivo PMN TEpM’nin önemini vurgular.
iLoop modeli, bağırsak homeostazı ve iltihabının tekrarlanabilir in vivo çalışmaları için son derece standartlaştırılmış bir yöntem sağlar ve IBD gibi hastalıklarda bağırsak bariyeri fonksiyonu ve mukozal inflamasyonun anlaşılmasını önemli ölçüde artıracaktır.
Introduction
Bağırsak mukozası, tek bir sütunlu bağırsak epitel hücrelerini (IECs), alttaki lamina propria bağışıklık hücrelerini ve kas mukozasını kapsar. Bağırsak epitel, besinlerin emiliminde rolünün yanı sıra, vücut içini ışıksal kommensal bakterilerden, patojenlerden ve diyet antijenlerinden koruyan fiziksel bir bariyerdir. Ek olarak, IEC’ler ve lamina propria immün hücreleri, bağlam ve uyaranlara bağlı olarak tolerans veya yanıt indükleyen immün yanıtı koordine edin. Epitel bariyerinin bozulmasının patolojik mukozal inflamasyonun başlangıcından önce gelebileceği ve hem ülseratif kolit hem de Crohn hastalığı 1 ,2 ,3,4,5,6,7‘yi kapsayan enflamatuar bağırsak hastalığına (IBD) katkıda bulunabileceği bildirilmiştir. Ülseratif kolitli bireyler, kript apseleri oluşturan polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) aşırı transepithelial göçünü (TEpM) sunar, hastalığın şiddeti ile ilişkili bir bulgu8,9. Her ne kadar tehlikeye atılmış epitel bariyer fonksiyonu ve aşırı immün yanıtlar IBD’nin ayırt edici özellikleri olsa da, bağırsak geçirgenliği ve bağırsak mukozasına bağışıklık hücresi alımının nicel değerlendirmelerini yapmak için deneysel in vivo testlerin eksikliği vardır.
Bağırsak epitel geçirgenliğini ve PMN TEpM’yi incelemek için kullanılan en yaygın yöntemler, yarı geçirgen gözenekli membran ekler10 , 11,12üzerinde kültürlenmiş IEC monolayerlerini kullanarak ex vivo oda bazlı yaklaşımlar kullanmaktadır. Epitel bariyer bütünlüğü, transepithelial elektrik direnci (TEER) ölçümleri veya Floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli dektranın apikal bölme13, 14,15ölçümleri ile izlenir. Benzer şekilde, PMN TEpM genellikle alt oda16’yaeklenen bir kemoattractant’a yanıt olarak çalışılmıştır. PMN üst bölmeye yerleştirilir ve bir kuluçka döneminden sonra bazal bölmeye taşınan PMN toplanır ve ölçülür. Bu yöntemler yararlı, gerçekleştirilmesi kolay ve çok tekrarlanabilir olsa da, açıkça indirgemeci yaklaşımlardır ve mutlaka in vivo koşulların doğru bir yansımasını temsil etmezler.
Farelerde, bağırsak parasellüler geçirgenliğini incelemek için yaygın bir test, FITC-dektran oral gavage ve daha sonra kan serumunda FITC-dektran görünümünün ölçülmesiile 13,17. Bu testin dezavantajı, bölgesel bağırsak katkılarından ziyade gastrointestinal sistemin genel bariyer bütünlüğünün bir değerlendirmesini temsil ediyor olmasıdır. Ek olarak, Evans mavisi yaygın olarak vasküler sızıntıyı değerlendirmek için kullanılır vivo 18 ve ayrıca fare ve sıçan19 , 20,21’dekibağırsak mukozal geçirgenliğini değerlendirmek içinkullanılmıştır. Evans mavisinin bağırsak mukozasında nicelemesi, bir gecede formamid inkübasyon kullanan dokudan ekstraksiyon gerektirir. Bu nedenle, aynı doku bağırsak epitel geçirgenliği ve nötrofil infiltrasyonunu incelemek için kullanılamaz.
Burada, kolon mukozal geçirgenlik ve lökosit transepithelial göç hakkında tekrarlanabilir veri toplamak için gereken hayvan sayısını azaltan basit bir protokolü vurguluyoruz. Bu nedenle, daha fazla analiz için hasat edilebilen bağırsak döngülerinin bütünlüğünden ödün vermeden kan serumunda kolayca tespit edilebilen FITC-dekstrans kullanılmasını öneririz. Not olarak, bağırsak ligli döngüler bakteriyel enfeksiyonu incelemek için çeşitli türlerde (fare, sıçan, tavşan, buzağı dahil) kullanılmıştır (Salmonella, Listeria monocytogenes ve Escherichia coligibi)22,23,24,25 ve bağırsak geçirgenliği26; bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, bağırsakta yaygın olarak IBD’de yer alan ileum veya kolon gibi belirli bölgelerde PMN TEpM mekanizmalarını araştıran hiçbir çalışma yoktur.
Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlanmış ve dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam ve güvenilir bir mikrocerrahi in vivo yöntemi olan fare bağırsak döngüsü (iLoop) modelini açıklıyoruz. iLoop modeli fizyolojik olarak ilgilidir ve anestezi altında yaşayan fareler üzerinde bağırsak bariyeri bütünlüğünün ve PMN TEpM’nin değerlendirilmesine izin verir. İki uygulama gösteriyoruz: 1) iLoop 2’de intralüminal uygulamadan sonra 4 kDa FITC-dektran serum seviyelerinin nicelemesi) güçlü kemotottractant Lökotrien B 4 (LTB4 )27’ninintralüminal enjeksiyonundan sonra iLoop lümeninde transmigrated PMN’nin nicelemesi. Ayrıca, iLoop modelini Jam-a-null fareler veya IEC’lerde seçici JAM-A kaybı barındıran farelerle kullanmak (Villin-cre; Jam-a fl/fl) kontrol farelerine kıyasla, sıkı kavşak ilişkili protein JAM-A’nın bağırsak geçirgenliğine ve nötrofil transmijasyonuna15,28 , 29,30,31için büyük bir katkı olduğunu bildiren önceki çalışmaları doğrulayabiliyoruz.
iLoop modeli, in vitro tahlilleri doğrulamak için kullanılabilecek son derece işlevsel ve fizyolojik bir yöntemdir. Ayrıca, bu, kemokinler, sitokinler, bakteriyel patojenler, toksinler, antikorlar ve terapötikler de dahil olmak üzere döngü lümenine enjekte edilebilen çeşitli reaktiflerin incelenmesine izin veren çok yönlü bir deneysel modeldir.
Protocol
Representative Results
Discussion
IBD gibi patolojik koşullar altında bağırsak bariyeri fonksiyonunun düzensizliği ve immün hücre alımından sorumlu mekanizmalar eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlı dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan ve bağırsak geçirgenliğinin, nötrofil göç çalışmalarının ve diğer uygulamaların değerlendirilmesine izin veren sağlam bir in vivo murine modelini detaylandırırız.
iLoop, canlı hayvanlara yapılan iyileşmeyen bir ame…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, proksimal kolon döngüsü modelinin kurulmasına katkılarından dolayı Wuerzburg Üniversitesi’nden Dr. Sven Flemming’e, fare kolonilerinin yönetimi için Sean Watson’a ve iLoop modelinin resimlerinin alınmasına yardımcı olduğu için Chithra K. Muraleedharan’a teşekkür ediyor. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı/DFG (BO 5776/2-1) tarafından KB, R01DK079392, R01DK072564 ve R01DK061379 ila C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
Referencias
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
