Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell

Tarmslimhinnen omfatter et enkelt lag med kolonne intestinale epitelceller (IECer), underliggende lamina propria immunceller og muskelslimhinnen. Foruten sin rolle i absorpsjonen av næringsstoffer, er tarmepitelet en fysisk barriere som beskytter kroppsinteriøret mot lysende kommensale bakterier, patogener og diettantigener. I tillegg koordinerer IECer og lamina propria immunceller immunresponsen som induserer enten toleranse eller respons avhengig av kontekst og stimuli. Det har blitt rapportert at forstyrrelsen av epitelbarrieren kan komme før utbruddet av patologisk slimhinnebetennelse og bidra til inflammatorisk tarmsykdom (IBD) som omfatter både ulcerøs kolitt og Crohns sykdom^{1,2,3,4,5,6,7}. Personer med ulcerøs kolitt presenterer overdreven transepithelial migrasjon (TEpM) av polymorfoukære nøytrofiler (PMN) som danner kryptabscesser, et funn som har vært forbundet med alvorlighetsgraden av sykdom^8,9. Selv om kompromittert epitelial barrierefunksjon og overdreven immunrespons er kjennetegn på IBD, er det mangel på eksperimentelle in vivo-analyser for å utføre kvantitative vurderinger av tarmpermeabilitet og immuncellerekruttering i tarmslimhinnen.

De vanligste metodene som brukes til å studere intestinal epitelial permeabilitet og PMN TEpM bruker ex vivo kammerbaserte tilnærminger ved hjelp av IEC monolayers dyrket på halvgjennomtrengelige porøse^{membraninnlegg 10,11,12}. Epitelial barriereintegritet overvåkes enten ved målinger av transepithelial elektrisk motstand (TEER) eller den paracellulære fluxen til Fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket dextran fra apikalt til basalrom^13,14,15. På samme måte studeres PMN TEpM vanligvis som svar på et kjemoattractant som legges til i det nedre^{kammeret 16}. PMN plasseres i det øvre kammeret, og etter en inkubasjonsperiode samles PMN som har migrert inn i basalrommet og kvantifiseres. Selv om disse metodene er nyttige, enkle å utføre og svært reproduserbare, er de åpenbart reduksjonistiske tilnærminger og representerer ikke nødvendigvis en nøyaktig refleksjon av in vivo-forhold.

Hos mus er en vanlig analyse for å studere intestinal paracellulær permeabilitet ved oral gavage av FITC-dextran og etterfølgende måling av FITC-dextran utseende i blodserumet^13,17. Ulempen med denne analysen er at den representerer en vurdering av den generelle barriereintegriteten i mage-tarmkanalen i stedet for regionale tarmbidrag. I tillegg brukes Evans blå ofte til å evaluere vaskulær lekkasje i vivo¹⁸ og har også blitt brukt til å evaluere intestinal slimhinne permeabilitet hos mus og rotte^19,20,21. Kvantifiseringen av Evans blå i tarmslimhinnen krever ekstraksjon fra vev som bruker inkubasjon i formamid over natten. Derfor kan det samme vevet ikke brukes til å studere intestinal epitelial permeabilitet og nøytrofil infiltrasjon.

Her fremhever vi en enkel protokoll som reduserer antall dyr som trengs for å samle inn reproduserbare data om kolonisk slimhinnegjennomtrengelighet og leukocytttransepithelial migrasjon in vivo. Vi anbefaler derfor bruk av FITC-dextrans som lett kan påvises i blodserum uten at det går på bekostning av integriteten til tarmløkker som kan høstes for videre analyse. Vær oppmerksom på at de tarmligalte løkkene har blitt brukt i ulike arter (inkludert mus, rotte, kanin, kalv) for å studere bakteriell infeksjon (som Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)^22,23,24,25 samt intestinal permeabilitet²⁶; Men så vidt vi vet er det ingen studier som undersøker mekanismer for PMN TEpM i bestemte regioner i tarmen som ileum eller kolon som ofte er involvert i IBD.

Her beskriver vi musens tarmsløyfe (iLoop) modell som er en robust og pålitelig mikrokirurgisk in vivo-metode som bruker et godt vaskulært og eksteriørisert tarmsegment av enten ileum eller proksimal kolon. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og tillater vurdering av tarmbarriereintegritet og PMN TEpM på levende mus under anestesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantifisering av serumnivåer på 4 kDa FITC-dextran etter intraluminal administrering i iLoop 2) kvantifisering av transmigrert PMN i iLoop lumen etter intraluminal injeksjon av potent chemottractant Leukotriene B₄ (LTB₄)²⁷. Videre bruker du iLoop-modellen med Jam-a-null mus eller mus som har selektivt tap av JAM-A på IECer (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) sammenlignet med kontrollmus, er vi i stand til å bekrefte tidligere studier som har rapportert et stort bidrag for tett koblingsrelatert protein JAM-A til intestinal permeabilitet og nøytrofiltransmigrasjon^{15,28,29,30,31}.

iLoop-modellen er en svært funksjonell og fysiologisk metode som kan brukes til å bekrefte in vitro-analyser. Videre er dette en allsidig eksperimentell modell som tillater studiet av ulike reagenser som kan injiseres i sløyfelumen, inkludert kjemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapeutiske midler.