Dysregulerad intestinal epitelbarriärfunktion och immunsvar är kännetecken för inflammatorisk tarmsjukdom som fortfarande är dåligt undersökt på grund av brist på fysiologiska modeller. Här beskriver vi en mus intestinal loop modell som använder en väl-vascularized och exteriorized tarm segment för att studera mucosal permeabilitet och leukocyte rekrytering in vivo.
Tarmslemhinnan kantas av ett enda lager epitelceller som bildar en dynamisk barriär som möjliggör paracellulär transport av näringsämnen och vatten samtidigt som man förhindrar passage av luminalbakterier och exogena ämnen. Ett brott mot detta lager resulterar i ökad permeabilitet till luminalt innehåll och rekrytering av immunceller, som båda är kännetecken för patologiska tillstånd i tarmen inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD).
Mekanismer som reglerar epitelbarriärfunktionen och transepithelial migration (TEpM) av polymorfonukleära neutrofiler (PMN) förstås ofullständigt på grund av bristen på experimentella in vivo-metoder som möjliggör kvantitativa analyser. Här beskriver vi en robust murin experimentell modell som använder ett exteriorized intestinala segment av antingen ileum eller proximal kolon. Den exterioriserade intestinala slingan (iLoop) är helt vascularized och erbjuder fysiologiska fördelar jämfört med ex vivo kammaren-baserade metoder som ofta används för att studera permeabilitet och PMN migration över epitelial cell monolayers.
Vi visar två tillämpningar av denna modell i detalj: (1) kvantitativ mätning av intestinala permeabilitet genom påvisande av fluorescens-märkta dextrans i serum efter intraluminal injektion, (2) kvantitativ bedömning av migrerade PMN över intestinala epitel i tarm lumen efter intraluminal införandet av chemoattractants. Vi visar genomförbarhet av denna modell och ger resultat med hjälp av iLoop hos möss som saknar epitelial tight junction-associerade protein JAM-A jämfört med kontroller. JAM-A har visat sig reglera epitelbarriärfunktionen samt PMN TEpM under inflammatoriska svar. Våra resultat med hjälp av iLoop bekräftar tidigare studier och belyser vikten av JAM-A vid reglering av intestinal permeabilitet och PMN TEpM in vivo under homeostas och sjukdom.
iLoop-modellen ger en mycket standardiserad metod för reproducerbara in vivo-studier av intestinal homeostas och inflammation och kommer avsevärt att öka förståelsen för tarmbarriärfunktion och slemhinnainflammation hos sjukdomar som IBD.
Intestinala slemhinnan omfattar ett enda lager av kolumnära intestinala epitelceller (IECs), underliggande lamina propria immunceller och muscularis slemhinnan. Förutom sin roll i absorptionen av näringsämnen är tarmepiteleriet en fysisk barriär som skyddar kroppens inre från luminal kommensala bakterier, patogener och dietantigener. Dessutom samordnar IECs och lamina propria immunceller immunsvaret inducera antingen tolerans eller svar beroende på sammanhanget och stimuli. Det har rapporterats att störningen av epitelbarriären kan föregå uppkomsten av patologisk mukosal inflammation och bidra till inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) som omfattar både ulcerös kolit och Crohns sjukdom1,2,3,4,5,6,7. Individer med ulcerös kolit presenterar överdriven transepithelial migration (TEpM) av polymorfokonukleära neutrofiler (PMN) bildar kryptabscesser, ett fynd som har associerats med svårighetsgraden av sjukdom8,9. Även om komprometterad epitelial barriär funktion och överdriven immun svar är kännetecken för IBD, finns det en brist på experimentella in vivo analyser för att utföra kvantitativa bedömningar av intestinala permeabilitet och immun cell rekrytering till intestinala slemhinnan.
De vanligaste metoderna som används för att studera intestinal epitelpermeabilitet och PMN TEpM använder ex vivo-kammarbaserade metoder med IEC-monoskikt odlade på halvgenomsläppliga porösamembraninsatser 10,11,12. Epitelbarriärens integritet övervakas antingen genom mätningar av transepithelial elektrisk resistans (TEER) eller det paracellulära flödet av Fluorescein isothiocyanate (FITC)-märkt dextran från apical till basal fack13,14,15. På samma sätt studeras PMN TEpM vanligtvis som svar på en kemoattraktiv som tillsätts i den nedre kammaren16. PMN placeras i den övre kammaren och efter en inkubationsperiod samlas PMN som har migrerat in i basalfacket och kvantifieras. Även om dessa metoder är användbara, lätta att utföra och mycket reproducerbara, är de uppenbarligen reduktionistiska metoder och utgör inte nödvändigtvis en korrekt återspegling av in vivo-förhållanden.
Hos möss är en vanlig analys för att studera intestinal paracellulär permeabilitet genom oral sondmatning av FITC- dextran och efterföljande mätning av FITC-dextran utseende i blodserum13,17. Nackdelen med denna analys är att det representerar en bedömning av den totala barriärintegriteten i mag-tarmkanalen snarare än den för regionala tarmbidrag. Dessutom används Evans blå ofta för att utvärdera vaskulär läckage in vivo18 och har också använts för att utvärdera intestinala slemhinnor permeabilitet i mus och råtta19,20,21. Kvantifieringen av Evans blå i tarmslemhinnan kräver extraktion från vävnad som använder inkubation i formamid över natten. Därför kan samma vävnad inte användas för att studera intestinal epitelpermeabilitet och neutrofiltration.
Här lyfter vi fram ett enkelt protokoll som minskar antalet djur som behövs för att samla in reproducerbara data om colonic mucosal permeability och leukocyte transepithelial migration in vivo. Vi rekommenderar därför användning av FITC-dextrans som är lätta att upptäcka i blodserum utan att äventyra integriteten hos tarmslingor som kan skördas för vidare analys. Observera att tarmligated slingor har använts i olika arter (inklusive mus, råtta, kanin, kalv) för att studera bakteriell infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes och Escherichia coli)22,23,24,25 samt intestinal permeabilitet26; Men så gott vi vet finns det inga studier som undersöker mekanismer för PMN TEpM i specifika regioner i tarmarna såsom ileum eller kolon som vanligtvis är involverade i IBD.
Här beskriver vi musens tarmslinga (iLoop) som är en robust och pålitlig mikrokirurgisk in vivo-metod som använder ett välvaskulärt och exteriöriserat tarmsegment av antingen ileum eller proximal kolon. ILoop-modellen är fysiologiskt relevant och möjliggör bedömning av tarmbarriärintegritet och PMN TEpM på levande möss under anestesi. Vi visar två tillämpningar: 1) kvantifiering av serum nivåer av 4 kDa FITC-dextran efter intraluminal administrering i iLoop 2) kvantifiering av transmigrerade PMN i iLoop lumen efter intraluminal injektion av potent chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Dessutom använder iLoop-modellen med Jam-a-nullmöss eller möss som hyser selektiv förlust av JAM-A på IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) jämfört med kontrollmöss, vi kan bekräfta tidigare studier som har rapporterat ett stort bidrag för tätt knutpunkts-associerade protein JAM-A till intestinal permeabilitet och neutrofiltransmigration15,28,29,30,31.
ILoop-modellen är en mycket funktionell och fysiologisk metod som kan användas för att bekräfta in vitro-analyser. Dessutom är detta en mångsidig experimentell modell som gör det möjligt att studera olika reagenser som kan injiceras i slinglumen, inklusive kemokiner, cytokiner, bakteriella patogener, toxiner, antikroppar och terapier.
De mekanismer som ansvarar för dysregulation av intestinala barriär funktion och immun cell rekrytering under patologiskt villkor såsom IBD är ofullständigt förstås. Här beskriver vi en robust in vivo murinmodell som använder ett välvaskulärt exteriöriserat tarmsegment av antingen ileum eller proximal kolon och möjliggör bedömning av intestinal permeabilitet, neutrofila migrationsstudier samt andra applikationer.
ILoop är en icke-återhämtningsoperation som utförs på levande…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Sven Flemming vid Universitetet i Wuerzburg för hans bidrag till inrättandet av den proximala kolonslingmodellen, Sean Watson för förvaltningen av muskolonierna och Chithra K. Muraleedharan för att hjälpa till med förvärvet av bilderna av iLoop-modellen. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen/DFG (BO 5776/2-1) till KB, R01DK079392, R01DK072564 och R01DK061379 till C.A.P.
Equipment and Material | |||
BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
Solutions and Buffers | |||
Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Reagents | |||
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |