Summary

إنشاء وصيانة بيوبنك الحية -- كيف نفعل ذلك

Published: April 10, 2021
doi:

Summary

في العمل التالي، ونحن وصف الخطوات المتتالية اللازمة لإنشاء بنك حيوي كبير من سرطان القولون والمستقيم والبنكرياس.

Abstract

في ضوء المعرفة المتزايدة حول الخصائص الفردية و عدم تجانس السرطانات ، يتطلب المجال الناشئ للطب الشخصي منصة للبحث قبل السريري. على مدى السنوات الأخيرة، أنشأنا بنك حيوي من سرطان القولون والمستقيم وسرطان البنكرياس التي تتألف من أنسجة الورم الأولية، والأنسجة العادية، والسايا، وخلايا الدم الطرفية المعزولة (PBL)، xenografts المستمدة من المريض (PDX)، فضلا عن خطوط الخلايا السرطانية الأولية والثانوية. منذ أنسجة الورم الأصلي محدودة ومعدل إنشاء خطوط الخلايا السرطانية الأولية لا تزال منخفضة نسبيا، PDX تسمح ليس فقط الحفاظ على وتوسيع بيوبانك ولكن أيضا توليد خطوط الخلايا السرطانية الثانوية. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أن نماذج PDX لتكون مثالية في نموذج vivo لاختبار المخدرات قبل الفحص. ومع ذلك، يتطلب العمل المصرفي البيولوجي إعداداً دقيقاً ومبادئ توجيهية صارمة وبنية تحتية منسجمة جيداً. يتم جمع عينات استئصال القولون أو استئصال الاثنيات أو استئصال الانبثاثات مباشرة بعد استئصالها ونقلها إلى قسم علم الأمراض. احترام أولوية تقرير الهدولوجي غير المتحيز ، بناء على تقدير الطبيب الشرعي الذي يقوم بالتشريح ، يتم حصاد قطع الورم الصغيرة والأنسجة غير الورمية.

يتم التخلص من الأجزاء النخرية ويتم قطع أنسجة الورم المتبقية إلى مكعبات صغيرة ومتطابقة ويتم تقديمها للتبريد لاستخدامها لاحقًا. بالإضافة إلى ذلك، يتم مفر جزء صغير من الورم وتوتر لثقافة الخلايا السرطانية الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يتم معالجة عينات الدم المسحوبة من المريض قبل الجراحة وما بعدها، للحصول على المصل و PBLs. بالنسبة لـ PDX engraftment ، يتم إذابة العينات المبردة وزرعها تحت الجلد في أجنحة الفئران المناعية. و PDX الناتجة عن قرب تَلخيص الأنسجة للأورام “المانحة” ويمكن استخدامها إما ل xenografting اللاحقة أو cryopreserved للاستخدام في وقت لاحق. في العمل التالي، ونحن وصف الخطوات الفردية لخلق، وصيانة وإدارة البنك الحيوي كبير من سرطان القولون والمستقيم والبنكرياس. وعلاوة على ذلك، فإننا نسلط الضوء على التفاصيل والمحاذير الحاسمة المرتبطة بالبنوك الحيوية.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أدت المعرفة المتراكمة لخصائص السرطانات السريرية والجينية إلى تصور السرطان كمرض فردي غير متجانس. وبالتالي، اكتسب توصيف الطفرات للأورام، بالإضافة إلى الميزات السريرية والمرضية، أهمية لاتخاذ القرارات السريرية وتم تطوير العديد من العلاجات المستهدفة لمختلف التعديلات الجزيئية. على سبيل المثال، يمكن التنبؤ بفعالية cetuximab في علاج سرطان القولون والمستقيم من خلال تحليل حالة الطفرات KRAS وPIK3CA 1. الطب الدقيق يهدف إلى اتباع نهج مصمم خصيصا لتوفير أعلى استجابة العلاج في كل مريض وتجنب سمية العلاجات غير المهينة2. تحتوي البنوك الحيوية على الأنسجة والدم والمواد البيولوجية الأخرى لمرضى السرطان ، والتي ترتبط بالبيانات السريرية ، وبالتالي فهي أداة ممتازة لأبحاث السرطان الترجمية. نظراً للعدد الكبير من العينات السريرية، تمكن البنوك الحيوية من الكشف عن الطفرات النادرة، ولكن يحتمل أن تكون قابلة للأدوية، والتي توفر فرص علاج جديدة للمريض الفردي3.

لتغطية أوسع قدر ممكن من طيف البحوث الأورام، ونحن لم تقييد نشاطنا على حصاد العينة وحدها، ولكن ركزت على إنشاء خطوط الخلايا السرطانية المستمدة من المريض وxenografts (PDX). تبقى خطوط الخلايا 2D التقليدية حجر الزاوية في البحوث في المختبر وهي الخيار الرئيسي لفحوصات المخدرات على نطاق واسع4,5. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يكون تحليل خط الخلية أسهل وأرخص وأكثر سهولة. بالإضافة إلى ذلك ، منذ المريض المستمدة من الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية (PBL) متوفرة ، كما يمكن دراسة علم المناعة الورم في المختبر6. ومع ذلك، فإن غالبية الأدوية المطورة حديثا مع الأثرية قبل السريرية واعدة في الخلية القائمة في المختبر أو في التجارب الحية، أظهرت نتائج مخيبة للآمال في التجارب السريرية7. في المقابل، وقد عكست الدراسات قبل السريرية على أساس PDX في الدراسات الجسمية النشاط السريري للعوامل antineoplastic أكثر من ذلك بكثيربأمانة 8. منذ أنسجة PDX يعكس عن كثب الخصائص النسيجية والجزيئية للورم المانح، نماذج PDX هي وسيلة جيدة لنشر كميات محدودة جدا في كثير من الأحيان من أنسجة الورم قابلة للحياة للحفاظ على سلامة البنك الحيوي والسماح لتبادل العينات بين مجموعات البحوث والمؤسسات. وعلاوة على ذلك، يمكن تأسيس خطوط الخلايا السرطانية المستمدة من أنسجة PDX أسهل بكثير من خطوط الخلايا السرطانية الأولية9. في السنوات الأخيرة، أنشأت مجموعة العمل لدينا متكاملة متكاملة القولون والمستقيم والبنكرياس السرطان البيولوجية عن طريق توحيد الخطوة وتعظيم تدفق العمل لجميع العينات البيولوجية في السؤال(الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل وتنظيم البنك الحيوي الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة التالية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمركز الطبي الجامعي روستوك (II HV 43/2004، A 45/2007، A 2018-0054، A 2019-0187 و A 2019-0222). وعلاوة على ذلك، وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات البيطرية ذات الصلة من قبل Landesamt für Landwirtschaft، Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern تحت أرقام التسجيل LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 و 7221.3-1-007/19. 1- المتطلبات المسبقة التجريبية تلبية العديد من الشروط الإطارية الهامة لإنشاء بنك حيوي والحفاظ عليه. استخدام عيادة مع قسم الجراحية وعدد كاف من استئصال الأورام جنبا إلى جنب مع مختبر مجهزة تجهيزا جيدا والموظفين الأكاديميين كافية. ومن الشروط الأساسية الأخرى وجود بنية تحتية جيدة وإقامة اتصال ثابت مع إدارة الأمراض المتعاونة. ل في أبحاث الجسم الحي، واستخدام منشأة حيوانية مع ظروف السكن المناسبة للفئران المناعية. الحصول على إذن بشأن أي بحث على المواد المشتقة من المريض من لجنة أخلاقيات الرعاية الصحية. الحصول على موافقة على أي بحث في الجسم الحي من السلطة المختصة وفقا للوائح القانونية المحلية. 2. عينة جمع اليوم السابق للجراحة تقييم جميع المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم القابل للاستئصال أو البنكرياس و / أو الانبثاث المقابلة لأهلية البنوك الحيوية. تجنب تضمين الحالات التي تحتوي على المعالجة المسبقة الجديدة ، أو أورام صغيرة جدًا ، أورام الكرامة غير المؤكدة أو الآفات التي تم استئصالها جزئيًا بالمنظار من قبل. الحصول على موافقة خطية على المشاركة من المريض خلال مناقشة الموافقة المستنيرة حول الإجراء الجراحي. إبلاغ جميع الجراحين المشاركين في الوقت المناسب، وفريق المختبر وكذلك أخصائي علم الأمراض. 2 – حيازة العينات إبلاغ جميع المرافقين في غرفة العمليات (OR) عن جمع الأنسجة للبنك الحيوي مباشرة قبل بدء العملية الجراحية.ملاحظة: من الأهمية بمكان أن الأنسجة يجب أن لا تكون ثابتة في formalin. إذا كانت الأنسجة مغمورة في الفورستين ، يصبح غير مناسب للبنوك الحيوية المتكاملة. رسم 40 مل من الدم heparinized (2 × 20 mL حقنة) وكذلك معيار 7.5 مل أنبوب المصل مباشرة بعد تحريض التخدير ونقلها بسرعة إلى المختبر لعزل PBL ومعالجة المصل (انظر الخطوة 3-4). الحصول على عينة مُجَذَّرَة مباشرة من جدول التشغيل، وضعه في حاوية مناسبة وأخذه إلى قسم المرضية. دوِّن نقطة الزمن من الانفصال عن الدورة الدموية، والفرز والوصول إلى علم الأمراض.ملاحظة: ينبغي تقييم مدى ملاءمة العينة للعمل المصرفي الحيوي من قبل أخصائي علم الأمراض المتعاون الذي يقوم بتشريح شريحة من الورم والأنسجة غير الخبيثة. لا تُجزِر أي أجزاء من العينة بنفسك مما قد يعرض التقرير المرضي اللاحق للخطر. ضع كلا القطع في 15 إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين مع 10 إلى 30 مل محلول تخزين الأنسجة (أو DPBS) على الجليد. دوّن وقت الاستلام ونقل العينات فوراً إلى المختبر.ملاحظة: يجب إجراء الخطوات البروتوكول التالية 3-6 في خزانة تدفق laminar تحت شروط معقمة صارمة. استخدام جميع السوائل في درجة حرارة الغرفة. 3. معالجة المصل جهاز طرد مركزي أنبوب مصل 7.5 مل في 1128 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي قبل التبريد. Aliquot 1 مل المصل لكل أنبوب في ما قبل المسمى والتبريد تجميد في النيتروجين السائل. 4. عزل PBL بواسطة الطاردة المركزية للتدرج الكثافة ملاحظة: العمل بالتوازي مع كل من اثنين من الحقن 20 مل. ملء 20 مل من الدم المهترئة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل وإضافة 15 مل من DPBS. تأخذ 15 مل من بانكول مع ماصة المصلية، إدراج ماصة بعناية على طول الطريق إلى الجزء السفلي من أنبوب البولي بروبلين والإفراج عن Pancoll ببطء شديد لتشكيل طبقة تحت العمود الدم / DBPS. جهاز طرد مركزي في 375 × ز لمدة 15 دقيقة بدون الفرامل. التعرق ونقل طبقة مُبَتَدِدة بين العمود الأوسط والعلوى لكلا العينتين إلى أنبوب بولي بروبلين 50 مل جديد وملء مع DPBS إلى 50 مل. جهاز طرد مركزي في 270 × ز لمدة 15 دقيقة مع الفرامل. التعرق والتخلص من افرحة, resuspend بيليه الخلية في 4.5 مل من متوسطة الفريزر. Aliquot 1.5 مل من التعليق لكل أنبوب cryotube، إغلاق الأنابيب بإحكام ووضعها في وعاء تجميد مناسبة لتجميد بطيئة وتخزينها في -80 درجة مئوية. 5. معالجة الأنسجة ملاحظة: ابدأ مع توليد عينات متجمدة من الأورام والأنسجة السليمة للحفاظ على سلامة الأحماض النووية. عينة أنسجة الورم نقل عينة الورم مع عدة مل من محلول تخزين الأنسجة من أنبوب البولي بروبلين إلى طبق بيتري. شطف مع DPBS إذا لزم الأمر. تجنب لمس العينة واستخدام مشرطين معقمة للتعامل مع الأنسجة. تجنب الجفاف في أي وقت. وزن عينة الورم على مقياس مناسب في طبق منفصل وملاحظة وزن الأنسجة. تقييم حجم وشكل ونوعية الأنسجة الورم قبل القطع. تهدف إلى الحصول على قطعة واحدة على الأقل حول حجم رأس الدبوس لتجميد المفاجئة وأربعة مكعبات من حوالي 30 ملم3 (طول الحافة 3 × 3 × 3 ملم) لكل من للتبريد الحيوية. توليد أكبر عدد ممكن 30 مم3 مكعبات في أربع مرات ممكن وتوليد قطعة واحدة لالتجميد المفاجئة لكل 5 رباعيات. أيضا أن تأخذ في الاعتبار أن الأجزاء النخرية يجب أن تقطع بحيث تتكون مكعبات من الأنسجة الحيوية فقط. توليد شرائح من 3 مم سمك. قطع أجزاء نخرية، يمكن تمييزها مثل هلام أو كتلة السائل، وقطع شرائح إلى مكعبات من الأحجام المطلوبة اثنين.ملاحظة: لا تتجاهل أي نسيج في هذه المرحلة. المفاجئة تجميد التسمية والتبريد وفقا لذلك (انظر الخطوة 7.7). ضع قطعة نسيج صغيرة واحدة لكل أنبوب التبريد المسمى مسبقًا. غمر العينات على الفور في النيتروجين السائل لعدة دقائق وتخزينها في -80 درجة مئوية في وقت لاحق. الحفظ بالتبريد للأنسجة الحيوية تسمية الأنابيب المبردة وفقا لذلك (انظر الخطوة 7.7) وملء كل مع 1.5 مل من متوسطة التجميد. ضع حاوية التجميد بجانب مقاعد البدلاء.ملاحظة: اتبع الخطوات التالية بأسرع وقت ممكن. منذ DMSO في المتوسط الفريزر له خصائص السامة للخلايا، وينبغي أن الوقت من الأنسجة التي يجري غمرها في المتوسط الفريزر دون التبريد السليم لا تتجاوز 2 دقيقة. ترتيب 30 ملممكعبات 3 في رباعية. يشق الأنسجة النخرية ويبقى أخرى على حافة الطبق، ولكن لا تجاهلها. استخرج المكعبات من شفرة المشرط ونقل 4 مكعبات لكل أنبوب cryotube. تأكد من أن قطع الورم مغمورة بالكامل في متوسط الفريزر. أغلق الأنابيب بإحكام ووضعها في حاوية متجمدة مناسبة للتجميد البطيء وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية. نقل الأنابيب المبردة إلى نظام تخزين مناسب للتخزين على المدى الطويل عند -140 درجة مئوية أو أقل. الوثائق في نظام إدارة المخزونات المختبرية إلزامية. عينة الأنسجة السليمة: كرر الخطوات 5.1.1. إلى 5.1.6.4 لعينة الأنسجة السليمة. 6. ثقافة الخلية الأساسية تفكيك بقايا نسيج الورم، بما في ذلك الخردة النخرية، في طبق بيتري مع المشرط إلى قطع صغيرة قدر الإمكان. ضع مصفاة الخلايا المعقمة (حجم المسام 100 ميكرومتر) فوق أنبوب بولي بروبلين سعة 50 مل. استخدام ماصة المصلية لإضافة 5-10 مل من DPBS إلى طبق بيتري، تعويم بقايا الأنسجة والماصات صعودا وهبوطا لتوليد تعليق. نقل تعليق مع ماصة إلى مصفاة الخلية. كرر الخطوات 6.3-6.4 حتى يتم حل جميع الأنسجة المتبقية من طبق بيتري. استخدام المكبس من حقنة 20 مل في اتجاه واحد للضغط على تعليق الخلية والأنسجة من خلال مصفاة الخلية. شطف مع 5-10 مل من DPBS الطازجة، والتخلص من مصفاة الخلية وإغلاق الأنبوب بشكل صحيح. الطرد المركزي تعليق في 180 × ز لمدة 5-10 دقيقة. إعداد الكولاجين-I precoated 6 لوحة جيدا مع 1.5 مل من المتوسط في البئر. التعرق وتجاهل المابير. Resuspend بيليه في 3 مل من DPBS أو المتوسطة وإضافة 500 μL من التعليق إلى كل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة (رطوبة 100٪، 5٪ CO2، 37 درجة مئوية) مراقبة لوحة يوميا لنمو الخلايا والتلوث.ملاحظة: لا يتم وصف المزيد من الخلايا زراعة حتى نقطة إنشاء خط خلية دائمة هنا. 7. PDX جيل إجراء تجاربi n vivo فقط من قبل أشخاص مؤهلين بشكل مناسب تلبية متطلبات السلطة المختصة في نطاق اختصاصك. الفئران المناعية المنزلية تحت ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) تلبية متطلبات سلالة الماوس المستخدمة. وتشمل التدابير الصحية أقفاص التهوية بشكل فردي، والطعام المُحمَّل بالمواد، والماء، ومواد التعشيش، فضلاً عن قفل الهواء الآمن وارتداء المعدات الشخصية والواقية. أوتوكلاف جميع الصكوك مسبقا واستخدام مجموعة واحدة فقط من الأدوات لكل حالة الورم لتجنب التلوث المتبادل. التعامل مع أنسجة الورم كما تعفن ممكن. يجب أن تكون جميع العناصر البلاستيكية المذكورة أدناه معقمة، واحدة الاستخدام والتخلص منها بعد كل عملية جراحية.ملاحظة: يحددها أسلوب تجميد أربع قطع من نسيج الورم لكل أنبوب تبريد، يتطلب جيل PDX دائماً فئران لكل عينة، مما يؤدي بشكل مثالي إلى أربعة أورام PDX. اختيار الورم الرئيسي المطلوب لengraftment عن طريق نظام إدارة المخزون المختبر ونقل العينة (حيوي الحفاظ على أنسجة الورم) من خزان التخزين الرئيسي لحاوية النيتروجين السائل المحمولة (التخزين الوسيط في -80 درجة مئوية على الجليد الجاف هو أيضا مريحة). وضع على معدات الحماية الشخصية قبل الدخول إلى SPF-القسم (الدعك، القباقيب، المئزر، غطاء الشعر، قناع الجراحية وإفراط الأحذية)، وتطهير يديك وجميع المعدات. ماتريجل تمرغ إزالة شكل شكل التبريد حاوية النيتروجين السائل، وتنتظر ذوبان العينة. تسمية أنبوب البولي بروبلين 50 مل وملء مع 35 مل من DPBS. إمالة التبريد صعودا وهبوطا ونقل المحتوى على الفور إلى أنبوب البولي بروبلين بمجرد أن يمكن تحويلها إلى الأنسجة المتوسطة الخدود. شطف بلطف قطع أنسجة الورم، والتخلص من حجم الرئيسي من أنبوب في وعاء منفصل، وإغلاق الغطاء ووضع أنبوب من الجانب إلى الأسفل، بحيث قطع الأنسجة الأربعة جمع في الغطاء. ضع طبق بيتري على مركم التبريد ووضع 100 ميكرولتر من ماتريجل كقطيرة واحدة في الوسط. استخدم ملقطًا تشريحية لنقل قطع الورم إلى ماتريجل. تأكد من أن كل قطعة مغطاة تماما مع Matrigel. احتضان لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية. ماوس التخدير (2 الفئران لكل عينة، والعمل في موازاة) إعداد 3:1- مخزون من الكيتامين (100 ملغ / مل) و xylazine (20 ملغ / مل) محلول مخدر. الجرعة الموصى بها هي 90/6 ملغم / كجم من وزن الجسم. وزن الماوس ورسم محلول التخدير اللازمة في حقنة الأنسولين استخدام واحد. وضع الماوس على شبكة القفص، وسحب ذيله بلطف بيد واحدة للحث على حركة إلى الأمام وسرطان البحر في وقت واحد الرقبة مع قبضة قرصة من ناحية أخرى. ارفع فأر الشبكة ودر اليد القابضة، بحيث يعود الحيوان إلى راحة يدك. قم بشل واحدة من الساقين الخلفيتين مع الخنصر الخاص بك وحقن المخدرات intraperitoneally. وضع الماوس مرة أخرى إلى قفصه، وينتظر الحث المخدرات. ضع الماوس المُغَدَّد على لوحة التسخين واغطي العينين بالمرهم لتجنب ضرر القرنية. يُقس عمق التخدير عن طريق قرص القدم الخلفية للماوس بلطف باستخدام ملقط جراحية.ملاحظة: غياب الحركة يشير إلى المخدرات العميقة. أي نوع من الحركة إما يتطلب المزيد من الوقت للوصول إلى عمق المخدرات المطلوب أو جرعة إضافية من التخدير. إجراء جراحي شكل أضعاف الجلد عن طريق معسر عنق الماوس وحقن رقاقة تحت الجلد مع قضيب (انظر الخطوة 9 لتفاصيل البرمجة) حلق أجنحة الماوس إذا لزم الأمر (NMRInu / nu الفئران لا تتطلب الحلاقة)، وتطبيق povidone اليود مع مسحة القطن واستخدام الستائر الجراحية لإنشاء حقل معقمة. رفع الجلد من الجناح مع ملقط الجراحية، وجعل شق صغير من حوالي 4 ملم وتشكيل جيب تحت الجلد الصغيرة عن طريق إعداد صريح مع مقص. ضع قطعة ورم واحدة في كل جيب وضعه في النهاية الخلفية. قص نهاية 100 ميكرولتر ماصة تلميح وpirate Matrigel المتبقية من طبق بيتري وتطبيقه على قدم المساواة في كل جيب الجلد. أغلق الجروح بخيوط بسيطة متقطعة وطبق صلصة الرش. مسح رقاقة والتحقق من صحة الماوس والورم معرف. إعداد قفص جديد مع الفراش الطازج والمواد التعشيش، فضلا عن عصا القضم. أضعاف “وسادة” من المناشف الورقية ووضع أسفل الماوس مع رأس مرتفعة تحت مصباح الحرارة الأشعة تحت الحمراء. مزيج 0.25 مل من تريميتهوبريم/سلفاميثوكسيزول (400 ملغ/80 ملغ) مع 100 مل من مياه الشرب، وتدار عن طريق زجاجة الشرب. ضع في اعتبارك أن فأرًا واحدًا يستهلك حوالي 150 مل لكل كيلوغرام من وزن الجسم يوميًا.ملاحظة: منذ لا يرتبط نموذج PDX تحت الجلد مع الألم بعد الجراحة، لا أثناء عملية التئام الجروح، ولا أثناء نمو الورم، لا يلزم المسكنات بعد الجراحة. يرجى ملاحظة أن المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان من مؤسستك / السلطة قد تختلف. رصد الحيوانات التجريبية مراقبة الفئران يوميا لعلامات الضيق. ويمكن تفويض هذا إلى مقدمي الرعاية الحيوانية المؤهلين. الحفاظ على العلاج بالمضادات الحيوية بعد الجراحة مع الجرعة المذكورة أعلاه لمدة 4 أسابيع. يُستعاض عن خليط المضادات الحيوية مرتين في الأسبوع. قياس حجم الورم مرة واحدة على الأقل في الأسبوع، من الناحية المثالية يوميا، مع الفرجر (حجم الورم = 0.52 × الطول × العرض × ارتفاع x [مم3])وسجل في قاعدة البيانات. 8. PDX الحصاد والتجهيز حصاد ومعالجة الورم PDX، عندما:يصل حجم الورم إلى الحجم المستهدف من 1.500 مم3.الورم الذي يحمل الحيوان يظهر علامات الضيق و / أو المرض والعلاج غير مجدية.الورم يصبح تقرح أو تخترق الجلد من الفأر. قراءة رقاقة لتحديد PDX الصحيح. القتل الرحيم الماوس عن طريق طريقة قانونية (اعتمادا على المبادئ التوجيهية الوطنية) على سبيل المثال CO2-الاختناق أو حقن الكيتامين / xylazine تليها خلع عنق الرحم. ارفع الجلد باستخدام ملقط جراحي على الجناحين و اِنزع مقص Metzenbaum على بعد بضعة ملليمترات من الورم. فصل الجلد فوق الورم عن طريق إعداد حادة، ثم فهم بعناية الورم مع ملقط التشريحية وفصل الورم من اللفافة السطحية للجسم. شطف الورم مع DPBS، ووضعها في طبق بيتري وإزالة النسيج الضام المجاورة. عند هذه النقطة، تنفيذ أحد ما يلي: قطع 30 مم3 مكعبات وإنشاء PDX جديدة (تابع مع بروتوكول في نقطة 7.7.4). قطع الورم إلى شرائح، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى كاسيتات علم الأنسجة والحفاظ عليها في الفورمالديهايد 4٪ لتضمين البارافين في وقت لاحق. الحفاظ على الورم في أنبوب مع محلول تخزين الأنسجة لإضافته إلى البنك الحيوي (المضي قدما مع بروتوكول في الخطوة 3.) و / أو إنشاء خطوط الخلايا المشتقة من PDX (المضي قدما مع بروتوكول في الخطوة 4.) 9- البنك الحيوي وإدارة البيانات تعيين معرف داخلي لكل حالة ورم وفقا للجدول 1. موقع المختبر/اسمه كيان السرطان عدد الحالات المتتالية مواصفات عدد متتالي C = القولون والمستقيم _Met = الانبثاث P = البنكرياس _Tu = الورم مثال: HROC389_Met2 = روستوك، سرطان القولون والمستقيم، الحالة 389، الانبثاث الثاني الجدول 1: تعريف معرف العينة. تخزين موافقة المريض في شكل إلكتروني وورقي مع الورم-ID. جمع أكبر قدر ممكن من البيانات السريرية وتخزينها مجهولة المصدر وبشكل منفصل. استخدام برنامج إدارة البيانات (على سبيل المثال، Freezerworks) أو غيرها، وإنشاء واجهة مع برنامج طباعة التسمية لتوليد مقاومة للحرارة، وتسميات رمز شريطية ذاتية التمسك. إضافة عينة جديدة عن طريق فتح برنامج إدارة البيانات، وتحديد نوع العينة وتسجيل المعلومات التالية: معرف الورم، ونوع الأنسجة، طريقة التجميد، والتاريخ، موظف مسؤول، رقم مرور، معرف الماوس وسلالة الماوس. تعيين العينات إلى مواقع محددة في خزان التخزين. تتبع ورصد PDX (ينطبق على الخطوة 7-8) استخدم قاعدة بيانات MS Access (أو نظام مماثل) على جهاز محمول مزود بتقنية البلوتوث (كمبيوتر محمول أو قرص) لتسجيل معرف الورم وتاريخ الزرع وتاريخ القتل الرحيم وعصر الماوس والإجهاد بالإضافة إلى نمو الورم بمرور الوقت. قم بتوصيل قارئ الرقائق الدقيقة بالجهاز وقراءة الرقاقة قبل الزرع. تعيين معرف معين لكل ماوس؛ نستخدم النظام التالي:(انظر الجدول 2 أدناه) بعد الزرع، سجل المعرف مع خصائص الماوس في قاعدة البيانات. إعادة قراءة رقاقة والتحقق، إذا كانت مواصفات رقاقة، قاعدة البيانات وتسمية والتبريد متسقة. إنشاء تسمية لكل قفص الماوس وفقا لذلك.ملاحظة: لإنشاء نسخة احتياطية فعلية، قم بلصق تسميات الـ cryotube مع تسميات الرقائق الدقيقة المقابلة في كتيب وتاريخ الملاحظات وسلالة الماوس. لرصد نمو الورم من PDX الفردية، مسح رقاقة من الماوس مع القارئ متصلا جهاز قاعدة البيانات لتحديد وتسجيل حجم الورم تقاس الفرجار كل أسبوع. تخطيط نقطة زمنية مثالية من حصاد PDX من خلال تحليل منحنى نمو الورم. معرف الورم التخزين المسبق في N2 (=f) رقم المرور (=T) رقم الماوس المتتالي (= M) مثال: HROP12 fT0 M1 = روستوك، سرطان البنكرياس، حالة 12، ولدت من الأنسجة الأولية المجمدة، مرور أول، ماوس 1. الجدول 2: تعريف معرف PDX.

Representative Results

في أيدينا ، كان معدل إنشاء الثقافات الخلية الأولية (الشكل 2A و B) 12.9 ٪ في سلسلة كبيرة9. فشلت غالبية المحاولات لعزل الخلايا السرطانية القابلة للتوسع من العينات الجراحية الطازجة التي تم استئصالها بسبب عدم وجود نمو أو تلوث مبكر. واعتبر إنشاء خط الخلية ناجحة بعد 3 ممرات مع نمو مطرد في ظل ظروف الثقافة القياسية (DMEM، 10٪ FCS، وعاء الثقافة القياسية) والتحقق من التمايز الظهارية عن طريق FACS-التحليل10. وأظهرت خطوط الخلية المستمدة من أورام PDX (الشكل 2C و D) ارتفاع معدل إنشاء 23.6 ٪ والذي يرجع أيضا إلى إمكانية تكرار محاولات على النقيض من الأورام الأولية9. ومع ذلك، لا يمكن تحرير بعض الثقافات المختلطة(الشكل 2E)من النمو الليفي أو حتى فقدت بسبب فرط النمو الليفي(الشكل 2F). الشكل 2: ثقافة الخلية. خطوط الخلايا السرطانية الأولية، المستمدة من الانبثاث من حالة سرطان القولون HROC313، مرور 21 (A) وسرطان البنكرياس HROP88، مرور 5 (ب). خطوط الخلايا السرطانية المشتقة من PDX من القولون PDX HROC285 T0 M2 (D) والبنكرياس PDX HROP10 T5 M2، مرور 4 (E). ثقافة مختلطة من الخلايا الليفية والخلايا السرطانية من سرطان البنكرياس HROP75، مرور 8 (C) والإفراط في النمو الليفي (F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. النظر في التغييرات في بروتوكول توليد PDX ، سلالات الماوس المستخدمة وكذلك المجربين على مدى عدة سنوات ، فضلا عن اختلافات كبيرة في كمية أنسجة الورم المتاحة لengraftment ، فإنه ليس من تافهة لإعطاء معدل النجاح الشامل من توليد PDX. في سلسلة حديثة جدا من تجارب توليد PDX التي يقوم بها اثنين من الباحثين (S.M. و F.B. ) ، لوحظت معدلات نمو أولية بنسبة 63٪ لـ PDX القولون والمستقيم (يمكن تصوير الأنسجة المثالية من الشكل 3A)و 48٪ لـ PDX البنكرياس(الشكل 3B). إن نمو الورم اللمفاوي أو الأورام اللمفاوية البشرية في موقع الزرع نادر نسبيًا ، ولكن يمكن أن يحاكي نمو PDX الناجح(الشكل 3C). وبصرف النظر عن الفحص الهدولوجي، تم تأكيد التوافق بين نماذج PDX ومرضى المتبرعين بها بانتظام من خلال تحليل التكرار القصير (STR)(الشكل 3D). حتى يومنا هذا يضم البنك الحيوي >50 الابتدائي >50 مستقيم الثانوية, 3 الابتدائي و 6 الثانوية خطوط خلايا سرطان البنكرياس وكذلك >150 القولون والمستقيم و 19 نماذج PDX البنكرياس. الشكل 3: المقارنة النسيجية التمثيلية لمستقيم (A) والبنكرياس PDX (B). سرطان الغدد الليمفاوية البشرية في موقع زرع تقليد خارج PDX (C). اختبار الهوية الوراثية لنموذج PDX (HROC430 T1 M2) إلى أنسجة الورم الأصلي المريض (HROC430Tu) عن طريق تحليل تكرار الترادف القصير (STR). مقارنة بين تسع عمليات Loci STR، vWA، THO1، TPOX، CSF1 PO (صبغة FAM) وD5S818، D13S317، D7S820، D16S539 (صبغة HEX) باستخدام متعدد PCR مع الأضواء الأولية ذات التسمية الفلورية بعد تأكيد التطابق الجيني للـ PDX والورم المانح (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

إن توليد بنك حيوي حي يفترض مسبقاً، إلى جانب الامتثال للأنظمة القانونية للخصوصية والقانون الطبي ورعاية الحيوان، وجود بنية تحتية جيدة وفريق منسق تنسيقاً جيداً. وقد ثبت من المفيد أن تشارك مباشرة جزءا من الطاقم الجراحي في إجراءات البحث، لأنها يمكن أن تقيم بشكل جيد جدا مدى ملاءمة المريض الفرد للتبرع الأنسجة. وعلاوة على ذلك، يميل المرضى إلى الموافقة على البنوك الحيوية بشكل أكثر تواترا، عندما يتم الحصول على موافقتهم الخطية في غضون مناقشة الموافقة المستنيرة الجراحية. لتوفير الوقت والموارد، لا ينبغي اختيار الحالات التي من المفترض أن تسفر عن كميات غير كافية من أنسجة الورم للبنوك الحيوية. عندما يتعلق الأمر بالحصول على العينة ، فإن مقولة “التواصل هو المفتاح” هي حقيقة بسيطة ، ولكن غالبًا ما يتم تجاهلها. يستغرق فقط ممرضة مسرح واحدة غير مطلعة أو زميل الجراحية لتدمير الحق في العينة في البداية من خلال المضي قدما كالمعتاد وإضافة الفورمالديهايد إلى عينة استئصال. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يتعرف كل فرد من الموظفين المعنيين على نظام العمل الموحد للبنوك الحيوية. يجب أن يكون لاحظت الجراحين في اليوم السابق والحق في بداية العملية حول جمع الأنسجة المقررة. وعلاوة على ذلك، ينبغي إبراز الحالات المختارة للبنوك الحيوية في الخطة الإلكترونية أو الإلكترونية. وينبغي أن يتم حصاد الأنسجة من العينة الجراحية من قبل أخصائي علم الأمراض. أولاً ، سيضمن هذا أن حصاد الأنسجة لا يتعارض مع التقرير المرضي النهائي. ثانيًا، يزيد هذا من احتمال تلقي الأنسجة بكميات كافية من الأنسجة السرطانية القابلة للحياة. خاصة في سرطان البنكرياس مع رد فعل دفكي واضح والمناطق النخرية المتكررة ، من الصعب تحديد الأجزاء القابلة للحياة بشكل جُعمي للعين غير المدربة. وكستثناء لهذه القاعدة، كتل الأنسجة من الانبثاث الكبدي أو الوثنية الوثنية الكبيرة، في بعض الأحيان يمكن استئصال “الطاولة الخلفية” من قبل الجراح، إذا كان يمكن تحديد الهوامش الجراحية العيانية. سرطان المستقيم استئصاله عن طريق استئصال الميزوركتال الكلي (TME) ، قد لا تكون مناسبة للبنوك الحيوية ، لأن حصاد الأنسجة من العينة التي تم استئصالها قبل تضمين البارافين قد تتداخل مع تقييم جودة TME. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على الأنسجة للبنوك الحيوية عن طريق خزعة عبر الشرج من سرطان المستقيم.

معدلات إنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من الورم الأصلي منخفضة عموما. يمكن أن يكون من المحتمل أن يتم تأسيس البيانات الموروثة الخلايا الثانوية المشتقة من PDX بنجاح. نوصي باختبار وسائل الإعلام المختلفة لكل حالة واستخدام مكملات المضادات الحيوية لالممرات الأولى للحد من التلوث إلى أدنى حد لأن الأنسجة التي يتم حصادها نادرا ما تكون معقمة. بعد الانتشار الناجح، ينبغي تأكيد كل خط خلية على حدة كخط خلية سرطانية بواسطة تحليل FACS واختباره بانتظام للتلوث الميكوبلازما. لاستبعاد التلوث المتبادل، من المستحسن إجراء تحليل منتظم لـ STR. وتجدر الإشارة إلى أن بروتوكول إنشاء خطوط الخلايا الأولية والثانوية يخضع باستمرار للتحسين. ومن الواضح أن التفاصيل المتعلقة بتكوين وسائط الإعلام الواحدة ومعدلات نجاحها تتجاوز نطاق هذا العمل وستنشر بشكل منفصل.

لPDX engraftment, يمكن زرع أنسجة الورم إما مباشرة بعد استئصال أو cryopreserved في مصل العجول الجنينية مع 10٪ DMSO أو وسائل الإعلام تجميد مماثلة لتأخر زرع. زرع مباشرة على أنسجة الورم الحصاد يضع ضغطا على موظفي الخدمات اللوجستية والمختبر، ونتائج xenografting بعد حفظ التبريد ليست أدنى في جميع 10. وعلاوة على ذلك، حضانة الأنسجة في Matrigel قبل زرع الورم، يزيد بشكل كبير معدلات engraftment12. نوصي بتأخر الحفر بعد اكتشاف مرضي محدد والتخلص الفوري من عينات الأنسجة التي تم جمعها خطأً. منذ معدل نجاح engraftment الأولية يزيد مع نقص المناعة من الماوس المتلقي، ونحن نميل إلى استخدام الفئران NSG لمرور PDX الأولى جدا. بعد أول نجاح PDX engraftment، يمكن وينبغي أن تستخدم الفئران NMRInu/nu لممرات لاحقة وتوسيع الأنسجة. هذه السلالة هي أكثر قوة وأرخص وأسهل في التكاثر مقارنة مع NSG أو سلالات المناعة المماثلة ، ولكنها لا تزال تظهر معدلات معقولة للانجرافت. وعلاوة على ذلك، فإن التعري يسهل الزرع ورصد نمو الورم. لزيادة معدلات engraftment في الممرات اللاحقة، نوصي النقل المباشر للأنسجة PDX حصادها حديثا لاستضافة الفئران كلما كان ذلك ممكنا، وخاصة بالنسبة لبطء النمو PDX والحالات مع انخفاض معدل نجاح engraftment الأولية. كولينز ولانغ استعرض مؤخرا 14 دراسات من إنشاء PDX القولون والمستقيم وأفادت معدلات engraftment تتفاوت من 14 إلى 100٪ مع متوسط معدل إنشاء PDX من 68٪، وهذا الأخير يتفق مع النتائج التيتوصلنا 13. تمشيا مع الأدب, لاحظنا انخفاض معدلات إنشاء البنكرياس مقارنة بسرطان القولون والمستقيم PDX14. بغض النظر عن سلالة الماوس المضيف والوريم الكيان، والخروج من الإنسان، Epstein-Barr فيروس (EBV) المرتبطة B-الخلايا اللمفوما والأورام اللمفاوية مورين في الجانب زرع يشكل مأزقا هاما15،16. إذا لم يتم التعرف عليها ، يمكن لمثل هذه الأورام “تلويث” المقاطع اللاحقة وبالتالي إرباك النتائج المتتالية. غير عادية نمو PDX السريع وتورم في عنق الرحم, الغدد الليمفاوية الإبطية والأربية هي مؤشرات قوية لنمو سرطان الغدد الليمفاوية مورين, ولكن الفحص النسيجي المنتظم من PDX ومع ذلك من المستحسن. وعلاوة على ذلك، ينبغي اختبار التوافق الجيني بين PDX والمريض المانح المقابل بانتظام عن طريق تحليل STR. ومن الناحية المثالية، ينبغي ربط البنك الحيوي بقاعدة بيانات سريرية تضم خصائص المرضى (المعلومات العامة، والبقاء على قيد الحياة، والانتكاس، والعلاج، والأورام الثانوية، وما إلى ذلك). نظرًا للأنظمة القانونية لحماية الخصوصية وعدم وجود قاعدة بيانات مجهولة المصدر ، يتم إدارة مجموعة البيانات السريرية الخاصة بنا وتحديثها يدويًا من قبل الأطباء المتعاونين.

وفي حين أن المصارف الأحيائية التقليدية تقتصر على بحوث المرصد، فإن المصرف الحيوي الحي يتيح الفرصة للتدخلات في المختبر وفي المختبرات الحية. خطوط الخلايا المستمدة من المريض هي أداة هامة للبحوث الأساسية، وارتفاع الإنتاجية فحص الأدوية وتقييم وكلاء الأدوية الجديدة4. نماذج PDX المقابلة، ومع ذلك، هي ذات أهمية متزايدة، لأنها تُستقَم عن كثب الأنسجة من الورم الأصلي17،18 وتظهر استقرار وراثي عالية على عدة مقاطع19،20. أثبت بنك PDX الحيوي نفسه كمنصة ممتازة للبحث قبل الكلينيكي والأساسي6،21. وعلاوة على ذلك، منذ مجموعات PDX كبيرة تعكس بشكل كاف التجانس بين الأفراد من السكان المرضى، وPX نهج التجارب السريرية (PCT) (حيوان واحد لكل نموذج لكل علاج) اكتسبت أهمية لتطوير المخدرات لأنه يسمح التنبؤ المؤمنين من الاستجابة السريرية للأدوية الجديدة ونظام الجمعبين 8. كما نقوم حالياً بتقييم العقاقير التجريبية الجديدة في تجارب معاهدة التعاون بشأن البراءات الصغيرة.

على الرغم من هذه النتائج الواعدة، وسيطة مدة إنشاء 12.2 الشهر، يعوق التطبيق السريري لنماذج PDX ك “الفئران الرمزية” لاختبار خيارات العلاج السرطاني، على الأقل بالنسبة لأولئك المرضى الذين يحتاجون إلى العلاج المساعد الفوري أو حتى neoadjuvant22. عيب إضافي من نماذج PDX القياسية هو عدم قابلية الاستخدام لاختبار العلاج المناعي بسبب نقص المناعة في الفئران المضيفة. للتغلب على هذه القيود، تم تطوير العديد من سلالات الماوس “الأنسانة”. هذه الفئران هي المناعية بشكل كبير، ولكن يمكن إعادة تشكيلها مع أنواع مختلفة من الخلايا المشتقة من نخاع العظام البشرية أو CD34+ الخلايا الجذعية الدموية اللاحقة لPDX خارج23، مما يسمح بتقييم السمية الخلوية التي تتوسطها الخلايا الليمفاوية والعلاج استجابة لعلاج مثبطات نقطة التفتيش المناعية24،25.

في السنوات الأخيرة، ظهرت الأجهزة العضوية المشتقة من المريض (PDO) كنماذج سرطانية مهمة تتنافس مع PDX. مشتقة من قطع الورم سليمة ومثقفة في سقالة مصفوفة خارج الخلية، وهذه الهياكل ثلاثية الأبعاد تعكس عن كثب الخصائص الهستوولوجي والوراثية للورم الأصلي. إمكانية التوسع على المدى الطويل والكوند إلى الحفظ يجعل PDO تكملة مثالية من26 ، 27من27. بالإضافة إلى معدل إنشاء مرتفع نسبيا, وقد تم الإبلاغ عن التنبؤ استجابة المخدرات موثوق بها لPDO من عدة كيانات الورم28. وعلاوة على ذلك، وقد ولدت حتى من خلايا الورم تعميم PDOs وأيضا إنشاء في وقت واحد من organoids من الأنسجة السليمة المقابلة من الممكن، مما يسمح لتقييم السمية ذات الصلة بالعلاج على أساس المريض الفردي29،30. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الثقافات التقليدية الخلية 2D ، والثقافة العضوية هو الوقت والموارد المستهلكة ومركبات المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية يمكن أن تتداخل مع بعض الإجراءات التحليلية31. وعلاوة على ذلك، فإن الأورام العضوية السرطانية عرضة للإفراط في النمو من خلال نمو أسرع، والأعضاء غير الخبيثة المستمدة من ظهارة صحية30. بسبب نقص الستروما والأوعية الدموية والخلايا المناعية ، فإن PDOs غير قابلة للتطبيق في الغالب لاختبار العوامل المناعية المضادة لمناعة الجهاز المناعي. حتى الآن، طرق جديدة زراعة تسمح نموس من الأورام microenvironment في المختبر،مما يجعل PDOs منافس حقيقي لنماذج PDX32. في المستقبل القريب، فإن نماذج الأورام بين المريض والأفراد، جنبا إلى جنب مع أدوات وراثية قوية مثل تسلسل الجيل القادم، ونأمل أن تمهد الطريق للطب الدقيق الحقيقي ونهج العلاج مصممة خصيصا.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نرحب بجيني بورمايستر، مساعدنا الرسومي، لتسجيل وتحرير الفيديو. وعلاوة على ذلك، نشكر زملاءنا في قسم الجراحة والمرض على التعاون الطويل الأمد. ونود أيضا أن نشكر ماركوس مولر، مدير الإنتاج في مركز تكنولوجيا المعلومات والإعلام، جامعة روستوك، لتوريد معدات التسجيل الصوتي وصقل جودة الصوت.

التمويل: المؤسسة الألمانية لمساعدة السرطان (DKH e.V.) ، وعدد المنح 108446 ، والمنحة رقم TBI -V-1-241-VBW-084 من ولاية مكلنبورغ فوربومرن مولت جزئيا هذا البحث.

Materials

Bacillol® AF; 1L Bode, Hartmann REF 973380 desinfection
PP centrifuge tube, 15ml; sterile Greiner Bio One GBO Cat. No.:188271 centrifuge tube
PP centrifuge tube, 50ml, sterile Sarstedt Order number: 62.547.254 centrifuge tube
BD DiscarditTM II Syringe 20ml BD REF 300296 blood collection
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette Sarstedt Item number: 01.1601 blood collection
serological Pipette 10ml Sarstedt REF 86.1254.001 liquid transfer
Pipetboy ratiolab® accupetta Ratiolab Item number: RL3200300 liquid transfer
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences VWR Cat.No: 613-4438 liquid transfer
DPBS; w/o Ca & Mg Pan Biotech Cat. No.: P04-36500 washing
Pancoll human Pan Biotech Cat. No.: P04-60500 density gradient centrifugation
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) PAN Biotech Cat. No.: P04-41500 cell cultivation
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) PAN Biotech Cat. No.: P40-47500 cell cultivation
L-Glutamine 200mM PAN Biotech Cat. No.: P04-80100 cell cultivation
Trypsin / EDTA PAN Biotech Cat. No.: P10-023100 cell cultivation
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) PanReac AppliChem VWR Cat.No: A3672.0250 cell freezing
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) selfmade cell freezing
cryotube- CryoPure 2ml Sarstedt 72380 cell freezing
6-Well cell culture plate; steril; with lid Greiner bio-one Cat.-No.: 657 160 cell cultivation
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams Sarstedt Cat. No.: 82.1472.001 tissue preparation
sterile surgical blades B.Braun (Aesculap) REF BB510 tissue preparation
BD DiscarditTM II Syringe 10ml BD REF 309110 tissue preparation
cell strainer; yellow; 100µm Falcon REF 352360 tissue preparation
CoolCell biocision Item number: 210004 cooling container with -1°C/min
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm KGW Cat. No.: HT39.1 transport system
Pipette tip 200µl Sarstedt REF 70.760.002 liquid transfer
Filter tip 1000µl Sarstedt REF 70.762.411 liquid transfer
Pipette 200µl, yellow Eppendorf Cat. No.: 3121 000.082 liquid transfer
Pipette 1000µl, blue Eppendorf Cat. No.: 3121 000.120 liquid transfer
incubator  BB 6220 CU Heraeus Cat.-No.: 51012839 cell cultivation
heating plate PRÄZITHERM Harry Gestigkeit GmbH heating
Microscope Zeiss Primo Vert Carl Zeiss MicroImaging GmbH Serial number. 3842000839 imaging cell cultures
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc nunc GmbH & Co. KG sterile working bench
freezer -80°C Kryotec-Kryosafe GmbH sample storage
Electronic balance MP-300 Chyo Scale
BD Micro-fine, U100 insulin syringe BD REF 324826 injection anesthetic
Rompun 2%; 25ml Bayer approval number: 6293841.00.00 anesthesia
Ketamin 100 mg/ml, 25ml CP-Pharma GmbH approval number: 401650.00.00 anesthesia
GES3S Reader Datamars not available RFID reader
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) Peddymark RFID chip
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml Ratiopharm PZN-03928197 antibiotic drinking water
Heating plate #FM-20 42x28cm Dragon heating
Heating lamp Electric Petra, Burgau heating
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen Bayer PZN-01578675 Eye protection
anatomical tweezer B.Braun Aesculap BD21 OR surgical instruments
surgical tweezer B.Braun Aesculap BD50 1 R surgical instruments
scissors B.Braun Aesculap BC05 6R surgical instruments
needle holder B.Braun Aesculap BH1 1 OR surgical instruments
Prolene 5-0 Ethicon XN8870.P32 surgical suture material
Opsite moisture vapour permable spray dressing Smith&Nephew REF 66004978, PZN- 02063507 surgical suture material
Adhesive aperture drape Barrier REF 904622 sterile OP tissue
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm Lohmann&Rauscher REF 18506 sterile OP tissue
Raucotupf cotton tipped applicators Lohmann&Rauscher REF 11969 applicator
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix Corning Cat.-No.: 354234 Basement Membrane Matrix
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) B.Braun Melsungen AG Item number: 18839 desinfection
MACS® Tissue Storage Solution Miltenyi Biotec GmbH Order No.:130-100-008 storage solution
Formafix 4% Grimm med. Logistik GmbH Item number: F10010G fixation solution
Software FreezerworksBasic Dataworks Development, Inc sample organization
Zebra TLP 2844 printer Zebra label printer

Referencias

  1. Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  3. Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
  4. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  5. Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
  6. Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
  7. DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
  8. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  9. Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
  10. Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 – a Crohn’s related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
  11. Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
  12. Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
  13. Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
  14. Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
  15. Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
  16. Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
  17. Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
  18. Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
  19. Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).
  20. Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
  21. Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
  22. Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
  23. Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice–a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
  24. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  25. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
  26. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  27. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  29. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  30. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  31. Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
  32. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).

Play Video

Citar este artículo
Bürtin, F., Matschos, S., Prall, F., Mullins, C. S., Krohn, M., Linnebacher, M. Creation and Maintenance of a Living Biobank – How We Do It. J. Vis. Exp. (170), e62065, doi:10.3791/62065 (2021).

View Video