Et λ-Red-mediert rekombinasjonssystem ble brukt til å lage en delesjonsmutant av en liten ikke-kodende RNA-micC.
Et ikke-kodende lite RNA (sRNA) er en ny faktor for å regulere genuttrykk på posttranskripsjonsnivå. En slags sRNA MicC, kjent i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke uttrykket av ytre membranproteiner. For ytterligere å undersøke reguleringsfunksjonen av micC i Salmonella Enteritidis, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336Δ micC ved λ Red-basert rekombinasjonssystem og det komplementerte muterte 50336Δ micCmicC som bærer rekombinant plasmid pBR322 som uttrykker micC. qRT-PCR-resultater viste at transkripsjon av ompD i 50336Δ micC var 1,3 ganger høyere enn i villtypestammen, mens transkripsjonen av ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 ganger og 3 ganger høyere enn de i villtypestammen. Disse indikerte at micC undertrykker uttrykket av ompA og ompC. I den følgende studien ble patogeniteten til 50336ΔmicC påvist av både infiserende 6 uker gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste at LD 50 av villtypestammen 50336, mutantene 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uker gamle Balb/c-mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD50 av stammene for 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 108 CFU. Det indikerte at sletting av micC økte virulensen til S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved å regulere ekspresjon av ytre membranproteiner.
Ikke-kodende små RNA (sRNA) er 40-400 nukleotider i lengde, som vanligvis ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uavhengig i bakterielle kromosomer 1,2,3. De fleste sRNA er kodet i de intergeniske regionene (IGRs) mellom genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA gjennom baseparingshandlinger, og regulerer målgenuttrykk på posttranskripsjonsnivå 4,5. De spiller viktige reguleringsroller i stoffmetabolisme, ytre membranproteinsyntese, quorumsensing og virulensgenuttrykk5.
MicC er et 109-nukleotid lite RNA-transkript tilstede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kan regulere flere ytre membranproteinuttrykk som OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer uttrykket av OmpC ved å hemme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det krever Hfq RNA-chaperone for sin funksjon i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium slår MicC av ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex i kodingssekvensen (kodon 23-26) og destabiliserer deretter endonukleolytisk mRNA7. Denne reguleringsprosessen er assistert av chaperone protein Hfq10. OmpC er et rikelig ytre membranprotein som ble antatt å være viktig i miljøer der nærings- og toksinkonsentrasjoner var høye, for eksempel i tarmen6. OmpD-porin er det mest tallrike ytre membranproteinet i Salmonella Typhimurium og representerer ca. 1% av totalt celleprotein11. OmpD er involvert i adherens til humane makrofager og tarmepitelceller12. MicC undertrykker også uttrykket til både OmpC- og OmpD-poriner. Det antas at MicC kan regulere virulens. For å utforske nye målgener regulert av MicC og studere virulensreguleringsfunksjonen til micC, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener ble screenet med qRT-PCR. Virulensen av 50336ΔmicC ble påvist av mus og kyllinginfeksjoner.
S. Enteritidis er et viktig fakultativt intracellulært patogen som kan infisere unge kyllinger og produserer symptomer fra enteritt til systemisk infeksjon og død17,18. I tillegg forårsaker S. Enteritidis latente infeksjoner hos voksne kyllinger og kroniske bærere forurenser fjærfeprodukter, noe som resulterer i matbårne infeksjoner hos mennesker19. Den patogene mekanismen til S. Enteritidis gjenstår å bl…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Chinese National Science Foundation (nr. 31972651 og 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
(NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |