פרוטוקול זה מספק שיטה ללמוד זיהום שחפת Mycobacterium במאקרופאגים אנושיים M1- או M2 מקוטבים המבוססים על בידול של מונוציטים היקפיים-דם לתאים דמויי מקרופאג’ הנגועים בזן הארסי H37Rv המסומן על ידי GFP, ומנותחים עם ציטומטריית זרימה באמצעות פאנל של 10 צבעים כולל ביטוי של סמני M1/M2 נבחרים.
מקרופאגים אנושיים הם תאים מארחים ראשוניים של שחפת מיקובקטריום תאית (Mtb) זיהום ולכן יש תפקיד מרכזי בשליטה החיסונית של שחפת (שחפת). הקמנו פרוטוקול ניסיוני למעקב אחר קיטוב חיסוני של תאים שמקורם במיאלואידים לתוך M1 (מופעל קלאסית) או M2 (לחילופין מופעל) תאים דמויי מקרופאגים באמצעות הערכה עם לוח cytometry זרימה 10 צבעים המאפשר הדמיה ואפיון עמוק של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-labeled Mtb בערכות מאקרו מגוונות. מונוציטים שהתקבלו מתורמי דם בריאים היו מקוטבים לתאי M1 או M2 באמצעות בידול עם גורם מגרה מקרופאג-מושבה גרנולוציטים (GM-CSF) או מקרופאג-מושבה מגרה גורם (M-CSF) ואחריו קיטוב עם IFN-γ ו lipopolysaccharide (LPS) או IL-4, בהתאמה. תאי M1 ו- M2 מקוטבים לחלוטין נדבקו ב- Mtb-GFP במשך 4 שעות לפני שמאקרופגים נגועים ב- Mtb היו מוכתמים בציטומטריית זרימה ב- 4 או 24 שעות לאחר ההדבקה. רכישה לדוגמה בוצעה עם cytometry זרימה והנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח cytometry זרימה. גטינג ידני, כמו גם הפחתת ממדיות עם קירוב והקרנה סעפת אחידה (UMAP) וניתוח פנוגרף בוצע. פרוטוקול זה הביא לקיטוב יעיל של M1/M2 המאופיין ברמות גבוהות של CD64, CD86, TLR2, HLA-DR ו- CCR7 בתאי M1 שאינם מושפעים, בעוד שתאי M2 שאינם מושפעים הציגו ויסות חזק של סמני פנוטיפ M2 CD163, CD200R, CD206 ו- CD80. תאים מקוטבים M1 הכילו בדרך כלל פחות חיידקים בהשוואה לתאים מקוטבים M2. כמה סמני M1/M2 היו downregulated לאחר זיהום Mtb, מה שמרמז כי Mtb יכול לווסת קיטוב מקרופאג. בנוסף, נמצאו 24 אשכולות תאים שונים בגדלים שונים המופצים באופן ייחודי בין התאים M1 ו- M2 שאינם נגועים בתאים נגועים Mtb ב 24 שעות לאחר ההדבקה. פרוטוקול cytometry זרימה M1/M2 זה יכול לשמש כעמוד שדרה במחקר Mtb-macrophage ולהיות מאומץ לצרכים מיוחדים בתחומים שונים של מחקר.
מקרופאגים הם תאים חיסוניים התורמים באופן משמעותי לוויסות הומאוסטזיס של רקמות, דלקת ופתולוגיות של מחלות. בהיותו מרכיב חיוני של חסינות מולדת, שושלת מונוציט-מקרופאז ‘של תאים מבטאת פנוטיפים הטרוגניים בתגובה לרמזים סביבתיים משתנים, המשקפים את הפלסטיות שלהם ואת הסתגלותם למקומות אנטומיים ואימונולוגיים שונים1. בהתאם לגורמי הגדילה, ציטוקינים ומתווכים אחרים הנמצאים במיקרו-ווירוניזציה, מקרופאגים סווגו לשתי אוכלוסיות הפיכות עיקריות, כל אחת עם תפקיד שונה בבקרה וסיווגחיידקיים 2: המקרופאג’ים הפרו-דלקתיים, המופעלים באופן קלאסי M1 והמאקרופאגים האנטי-דלקתיים, המופעלים לחילופין M2-מקוטבים שנקראו במקור לחקות את T helper (Th) nomenclature3. קיבוץ זה של מקרופאגים מקוטבים חיסוניים נחשב לעתים קרובות פשטני, כמו הפעלת מקרופאג ובידול אינו ליניארי, אבל יותר מדויק כמו רצף שבו לכל אוכלוסייה יש מאפיינים שונים ותפקידים תפקודיים בתוצאה של התפתחות המחלה והתקדמות4,5,6,7. עם זאת, ישנם יתרונות ניסיוניים רבים עם מודל מקרופאג M1/M2 שניתן להשתמש בהם במספר תחומי מחקר שונים.
שחפת Mycobacterium (Mtb) הוא הסוכן הסיבתי של שחפת (שחפת) והוערך להדביק אדם אחד בכל שנייה ונחשב לסוכן הזיהומי הקטלני ביותר בעולם (דו”ח שחפת גלובלי 2019). מאז דרכי הנשימה הוא התוואי העיקרי של זיהום Mtb, מקרופאגים מכתש הם התאים המארחים המועדפים להיות נגועים Mtb ומייצגים הן את המחסומים העיקריים ואת המאגר זיהומיות עבור Mtb בריאות. קיטוב מקרופאג בתגובה לגירויים שונים נחקר בהרחבה לאורך השנים7 וברוב העבודה שפורסמה, M1 קיטוב של תרבויות מונוציטים במבחנה הוא המושרה על ידי גרנולוציטים-מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-CSF) יחד עם IFN-γ ו LPS8,9, בעוד קיטוב M2 הוא המושרה עם מקרופאג מושבה מגרה פקטור (M-CSF) ו IL-410,11. מקרופאגים M1 הם תאים משפיעים חזקים המתווכים תגובות מיקרוביאלית נגד פתוגנים תאיים ויש להם תפקיד חיוני בחסינות antitumor12. מקרופאגים M2, לעומת זאת, יש פונקציה אנטי דלקתית, יכולת phagocytic גבוהה מעורבים בעיקר ריפוי פצעים ותיקון רקמות, כמו גם בזיהומים טפיל12. בהתאם לכך, מקרופאגים M1 נתפסים כיעילים יותר בשליטה תאית של Mtb בהשוואה למאקרופאגים M213. עם זאת, חיידקי Mtb יש גם פוטנציאל לווסת קיטוב מקרופאג לחתור תחת חסינות מולדת14,15,16,17.
אמנם זה נפוץ ליצור מקרופאגים מהבחנה של מונוציטים המתקבלים מדם היקפי18, מקרופאגים יכולים להיווצר גם מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSCs)19 או מקרופאגים שמקורם במח העצם מעכברים20,21. אלה הן טכניקות אפשריות ללמוד תאי מקרופאג ראשוניים המתקבלים מאבות מונוציטים/מקרופאגים שיהתרבותו ויתבדלו לאוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי מקרופאג’ בוגרים. עם זאת, פרוטוקולים אלה לעתים רחוקות לספק ידע מעמיק על פנוטיפ ותפקוד של התאים שהושגו ולא להסביר את ההטרוגניות הטבעית שנצפו בקרב מקרופאגים שהושגו vivo. כמו Mtb הוא פתוגן אנושי קפדני, יש גם יתרון ללמוד Mtb במערכות מודל אנושי. זרימה cytometry היא טכנולוגיה רבת עוצמה המציעה את האפשרות להעריך מאפיינים פנוטיפיים ופונקציונליים מרובים של תאים בודדים בהשעיה22, משהו שיכול להיות מאתגר למדי עם תאים חסידיים כגון מקרופאגים הידועים גם להיות autofluorescent23,24. בנוסף לניתוק כימי של מקרופאגים חסידים היטב, זיהום Mtb עשוי להוות גורם לחץ משמעותי לתאים המוסיף רמה נוספת של מורכבות בניתוחים ציטומטריים זרימה של מקרופאגים נגועים Mtb.
בפרוטוקול ניסיוני זה, השתמשנו במודל זיהום מקרופאג אנושי שהוקם בעבר בהתבסס על קיטוב חיסוני של תאים ראשוניים המופקים מדם-דם-מונוציט הנגועים במעבדה הארסית Mtb strain H37Rv, ונותחו עם ציטומטריית זרימה באמצעות פאנל של 10 צבעים כולל ביטוי של סמני M1 ו- M2 נבחרים25. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה הניתנת לשחזור כדי ללמוד תגובות לזיהום Mtb במקרופאגים M1 או M2 מקוטבים שמקורם במונוציט. בנוסף, השימוש בציטומטריית זרימה על מקרופאגים נגועים Mtb חסידים מאפשר לנו ללמוד מגוון של סמני פני השטח הקשורים M1 ו M2 מקרופאגים קונבנציונאלי ואת התגובה האורך שלהם לזיהום Mtb. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מאומץ לחקירות של זיהומים עם פתוגנים אחרים, במחקרים נגד גידולים או במחקרים של תנאים דלקתיים, עבור הקרנת תרופות וכו ‘, והוא יכול גם להיות מנוצל להערכת קיטוב מקרופאז M1/M2 בדגימות קליניות אנושיות.
פרוטוקול ניסיוני זה מתאר קיטוב יעיל של תאים שמקורם במיאלואידים לתוך פנוטיפים M1 או M2 כולל הערכה עם פאנל cytometry זרימה 10 צבעים המאפשר הדמיה ואפיון עמוק של Mtb GFP שכותרתו בתת-קבוצות מקרופאגים מגוונות. למרות שחפת היא מחלה אנושית עתיקה, אין כיום מודל תקן הזהב ללמוד אינטראקציות Mtb-macrophage, ו cytometry זרימה מרובת צבעים של מקרופאגים יכול להיות מסובך בהשוואה לניתוחים של תגובות לימפוציטים. פרוטוקולים זמינים מעטים לבידול במבחנה של מונוציטים אנושיים למאקרופאגים מציגים ידע עמוק על סוג המקרופאגים הנוצרים. פרוטוקול בסיסי לקיטוב מקרופאז’ והערכה ציטומטרית זרימה של הפעלת מקרופאג’ באמצעות פאנל מוצק של סמנים עשוי להקל על אפיון כזה ולהציע הזדמנויות לחקור תכונות נוספות של תאים מקוטבים שטופלו בתנאים שונים. זה כולל ניתוחים של תאים בתרבית במבחנה, כמו גם ניתוחים של תאים vivo בדגימות קליניות, כלומר, הן PBMC והן מתלים חד-תאיים מנוזלי גוף (כלומר, שטיפת סימפונות) או רקמה הומוגנית. לפיכך, בידול ו/או מצב הפעלה של מונוציטים ומאקרופאגים המתקבלים מחולים עשויים להיות קשורים לתוצאות המחלה. הרחבה של CD16+CD163+ מונוציטים בדם היקפי דווחו בחולי שחפת ריאות30. תדירות מוגברת של CD163+ תאים זוהתה גם בעור מודלק של חולי אטופיק דרמטיטיס31. באופן דומה, CD206+ מקרופאגים דמויי M2 הוכחו לעכב התפשטות ובידול של תאים microenvironment של רקמת adipocyte32 ולהיות מועשר בדגימות מח עצם מחוות עצם מחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)29. יחס גבוה של CD64 (M1) לתאי CD163 (M2) בדם שלם של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית נמצאה קשורה לחומרת המחלה33. מחקר אחר השתמש CD86 (M1) ו CD163 (M2) כדי להדגים כי ביטוי M1 גבוה ברקמה בקורלציה לתוצאה גרועה יותר בקבוצה משנה של גידולים ממאירים במוח34.
ישנם מספר יתרונות משמעותיים של פרוטוקול ציטומטריית זרימה M1/M2 ניסיוני זה. מודל זה מספק את ההזדמנות ללמוד תגובות חיסוניות מולדות לזיהום Mtb ארסי וניתן לפתח אותו כך שיכיל מחקרים של תגובות חיסוניות אדפטיביות על ידי הוספת תאי T אוטולוגיים יחד עם מקרופאגים M1 או M2 בתגובות מעורבות לימפוציטים (MLRs). הפרוטוקול מתאים גם להקרנת תרופות ובדיקות של תרכובות אימונומודולטוריות ומיקרוביאליות שונות. כאן, חקרנו בעבר את ההשפעות של ויטמין D ואת מעכבי deacetylase histone פנילבוטיראט על תאים שמקורם מיאלואידית לאחר זיהום Mtb25,35. Cytometry זרימה M1/M2 יכול לשמש גם כדי להעריך הפעלת מקרופאג לאחר מיזוג עם supernatants תרבות התא או פלזמה המטופל. בעוד במחקרים vivo של זיהום משותף שחפת עם HIV או helminths או שחפת סוכרת שיתוף תחלואה יכול להיות מאתגר, מודל M1/M2 מורכב פחות עשוי להקל על מחקרים של תחלואה משותפת במבחנה. כמו כן, הפרוטוקול יכול להיות מנוצל למחקרי שידור כדי לבחון את זיהומיות Mtb של תאים או לחקור phagocytic, כמו גם קיבולת הצגת אנטיגן של תאים בודדים M1/M2. ציטומטריית זרימה M1/M2 היא גם אטרקטיבית לשימוש במחקרי סמנים ביולוגיים וחיסונים, לעקוב אחר פרוגנוזה של מחלות במהלך הטיפול ולבדוק טיפולים המכוונים לתאים שמקורם במיאלואידים. חשוב לציין, ניתן ליישם מספר שיטות שונות במקביל לזרימה ציטומטריה להערכה בו זמנית של פנוטיפים של קיטוב מקרופאז’ ותגובות תפקודיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 3D), PCR בזמן אמת, כתם מערבי, מבחני מולטיפלקס ו ELISA של גורמים מסיסים בתרבות supernatant, כמו גם הערכה של זיהומיות חיידקים תאיים וצמיחה באמצעות ביטוי GFP (cytometry זרימה מיקרוסקופיה confocal) ויחידות להרכיב מושבה (CFU). זיהום של תאי M1 או M2 עם חיידקי Mtb-GFP מאפשר גם מיון התאים שאינם נגועים ו- Mtb נגועים מאותה מדגם לניתוח רצף תא יחיד-RNA.
לפרוטוקול המתואר יש גם כמה מגבלות כולל חסרונות טכניים ומדעיים כאחד. החיסרון בשימוש במקרופאגים שמקורם במונוציט מתורמי דם אנושיים הוא שהשונות בין התורמים לעתים קרובות גבוהה והעובדה שהתאים אינם מקוטבים בסביבה הפיזיולוגית של רקמות אנושיות. שונות גדולה ביעילות הקיטוב M1/M2 או Mtb-infectivity בין תורמים עלולה לגרום לבעיות עם וריאציות תוך-מקצועיות ובין-מקצועיות, כוח סטטיסטי נמוך וצורך לכלול תורמים רבים כדי להשיג תוצאות אמינות. בנוסף, הדבקות בפלסטיק של מונוציטים ממחשבי PCBMCs גורמת למספר תלוי תורם של מונוציטים /well שעשויים בסופו של דבר לספק MOI שרירותי שעלול להשפיע על קיטוב המקרופאג’ ועל הכדאיות של התאים לאחר זיהום Mtb. שלבים קריטיים בפרוטוקול כרוכים בכביסה נכונה כדי למנוע מסוגי תאים אחרים לזהם את תרביות התאים שעלולות להשפיע גם על קיטוב מקרופאגים. בעוד MOI נמוך מדי עשוי לחקות זיהום שחפת סמוי, MOI גבוה מדי יהרוג את התאים, הדגשת החשיבות של שימוש MOI מתאים. יתר על כן, זה יכול להיות קשה לאחזר תאים חסידים בתקיפות על ניתוק, אשר עלול לגרום ייצוג מוטה של קבוצות משנה מסוימות מקרופאגים המשמשים לניתוחי cytometry זרימה. שלב מכריע בניתוח cytometry זרימה כרוך בשימוש נכון של מטריצת פיצוי חרוזים ופקדים שליליים כגון תאים מוכתמים או FMO (פלואורסצנטיות מינוס אחד) פקדים כדי להבטיח גטינג ידני נכון.
מגבלה נוספת כרוכה בקיטוב של מונוציטים שמקורם בדם ולא מסביבת הרקמות המקומית. סימן ההיכר של שחפת אנושית הוא היווצרות של גרנולומות ברקמות נגועות Mtb ולכן, אימונופתולוגיה בשחפת צריך להיות למד באופן מועדף באתר הרקמה המקומית. עם זאת, מונוציטים מגויסים לריאה מדם היקפי על דלקת / זיהום, שבו תאים יכולים להבדיל למקרופאגים בנוכחות ציטוקינים דלקתיים כגון GM-CSF12. חשוב לציין, במילייה הפיזיולוגי של הרקמה ב vivo, סביר להניח שיש הטרוגניות גדולה של קיטוב מקרופאז כולל תערובת ויחסים שונים של אוכלוסיות מקרופאגים מגוונות דמויות M1 ו- M2 התורמות לגורל זיהום שחפת36. פיתחנו בעבר מודל רקמת ריאה organotypic אנושי המאפשר 3D-מחקרים של היווצרות גרנולומה בתיווך מקרופאג ב TB37. זה יכול להיות מעניין לנצל את פרוטוקול הקיטוב הנוכחי M1/M2 בשילוב עם מודל רקמת הריאה כדי להמשיך לחקור היווצרות גרנולומה שחפת, פונקציות אפקטים ויחס M1/M2 ברקמה ניסיונית.
פרוטוקול זה M1/M2 flowcytometry יכול בקלות להיות מותאם לכלול פאנל מורחב של סמנים מיאלואידים שימושי להערכת תכונות הקשורות מעכבות, כמו גם תגובות דלקתיות. יש עניין מחקרי רב במולקולות נקודת ביקורת חיסונית מעכבות כגון PD-1, SIRP-α, IDO וארגינאזות שיכולות לווסת תגובות מקרופאז’38. בהקשר זה, קיטוב של תאים מיאלואידיים יכול לכלול גם גירויים אחרים המקדמים מקרופאגים אימונורגולטוריים (Mreg) או תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSC) שהוכחו כמעורבים במספר מחלות כולל שחפת38. לוחות ציטומטריה זרימה מתקדמים יותר של תת-קבוצות מקרופאג M1/M2/Mreg עשויים לכלול גם כתמים תאיים של ציטוקינים/כימוקינים IL-1β, TNF-α, IL-10 ו- MCP-1 או גורמים מסיסים אחרים או מולקולות אפקט כגון תחמוצת חנקן בלתי ניתנת להכנה (iNOS) ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים. זה יכול לשפר את האפשרויות ללמוד תגובות מקרופגות רב תכליתיות, בדומה למה שתואר בהרחבה עבור תאי T39.
נכון לעכשיו, לוחות הכתמת ציטומטריה זרימה יכולים לכלול עד 30-40 צבעים, אשר מספק את היכולת immunophenotype תת-קבוצות תאים מרובים ומולקולות בו זמנית. ההגדרה הניסיונית הבסיסית של פרוטוקול cytometry זרימה M1/M2 זה יכולה לשמש כעמוד שדרה התואם לרוב סיטומטרים ישנים וחדשים של זרימה וניתן לבנות עליהם ולהתאים אותם בהתאם לצרכים האישיים, כולל האתגרים שמציבה העבודה עם Mtb הארסי בסביבת BSL-3. כיום, טכניקות להפחתת ממדיות כגון UMAP זמינות בגירסאות החדשות של תוכנת cytometry זרימה, המאפשר ניתוח של מספר רב של פרמטרים שנוצרו במחקרים חד-תאיים החיוניים להדמיה משופרת ופרשנות של נתונים מימדיים גבוהים40. השיפורים הטכנולוגיים המתמידים בציטומטריית זרימה צפויים להימשך בשנים הקרובות, כולל השילוב של פנוטיפים רב-פרמטריים יחד עם יכולות מיון תאים מודרניות, שם פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי במספר מבחני זיהום Mtb מבוססי מקרופאג’.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לעמיתינו בסוכנות לבריאות הציבור של שבדיה, מטילדה סוונסון וסולומון גברמייקל על הסיוע במעבדת BSL-3.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן הלב והריאות השוודית (HLF) (2019-0299 ו-2019-0302 ל-SB), מועצת המחקר השוודית (VR) (2014-02592, 2019-01744 ו-2019-04720 עד SB), הקרן למניעת עמידות לאנטיביוטיקה (התנגדות), קרנות מכון קרולינסקה ו-KID ל-SB (מימון חלקי של חינוך לדוקטורט למרקו לורטי) ממכון קרולינסקה. ML נתמכה על ידי הקרן השוודית לסרטן ילדים (TJ2018-0128 ויחסי ציבור 2019-0100).
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |